Hóa chất và thời gian khử trùng mẫu phải đảm bảo tiêu diệt các nguồn gây nhiễm như nấm và vi khuẩn. Các mẫu cấy đã chọn được rửa bằng xà phòng dưới dòng nước chảy rồi mới cho vào ngâm trong dung dịch khử trùng. Để tăng khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, thông thường người ta xử lớ mụ nuôi cấy trong cồn 70% trong 30 giây đến 1 phút, sau đó mới xử lí trong dung dịch diệt khuẩn. Trong thời gian xử lớ, mụ cấy phải được ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt khuẩn. Khi xử lí xong mô cấy được rửa nhiều lần trong nước cất vô trùng (3-5 lần).
Một số hóa chất thường được sử dụng để khử trùng mẫu cấy trong nuôi cấy in vitro được trình bày trong bảng 2.1:
Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương
Bảng 2.1: Các hóa chất thường dùng trong việc khử trùng mẫu cấy
Stt Hóa chất Nồng độ Thời gian khử trùng (phút) Hiệu quả 1 Hypochlorite calcium 9 – 10% 5 -30 Rất tốt 2 Hypochlorite sodium 0,5 – 5% 5 -50 Rất tốt 3 Nước bromine 1 – 2% 2 -10 Rất tốt 4 Oxy già 3 – 12% 5 – 15 Tốt
5 Chlorua thủy ngân 0,1 – 1% 2 -10 Tốt
6 Nitrate bạc 1% 5 -30 Tốt
7 Kháng sinh 4 – 50mg/l 30 - 60 Khá
Trong nghiên cứu này, 3 loại hóa chất khử trùng mẫu được sử dụng là: - Hypochlorite sodium (NaOCl) nồng độ 2,25%.
- Chlorua thủy ngân (HgCl2) nồng độ 0,1% - Oxy già (H2O2) nồng độ 15%.
Các hóa chất trên có thể sử dụng độc lập để khử trùng (khử trùng đơn) hoặc được phối hợp với nhau (khử trùng kép). Thí nghiệm khử trùng mẫu trong nghiên cứu này được bố trí theo bảng 2.2:
Bảng 2.2: Các thí nghiệm công thức khử trùng
Phương pháp Hóa chất Thời gian khử trùng (Phút) Khử trùng đơn NaOCl 2,25% 20; 25 HgCl2 0,1% 9; 12 Khử trùng kép NaOCl 2,25% + NaOCl 2,25% 10 + 15; 12 + 18; 15 + 20 HgCl2 0,1% + NaOCl 2,25% 7 + 15; 10 + 20; 10 + 25 HgCl2 0,1% + HgCl2 0,1% 5 + 7; 7 + 9 H2O2 15% + NaOCl 2,25% 13 + 15
Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương
Các công thức khử trùng trên được tiến hành ở tất cả cỏc dũng lỳa nghiên cứu, riờng dũng N46 được tiến hành thêm một công thức khử trùng là: HgCl2 0,1% + HgCl2 0,1% trong thời gian 10 + 15 phút.
Trong mỗi thí nghiệm, chúng tôi tiến hành theo dõi các chỉ tiêu: - Tỷ lệ mẫu sống
- Tỷ lệ mẫu chết - Tỷ lệ mẫu nhiễm.
Qua đó đánh giá hiệu quả của công thức khử trùng đối với từng dòng.