DNA tổng số từ các mẫu lá non đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp của Saghai Maroof và cộng sự (1984) [38] có cải tiến, với thành phần đệm chiết ở bảng 2.2. Bảng 2.2. Thành phần đệm tách DNA tổng số STT Nồng độ gốc Nồng độ sử dụng 1 Tris-HCl 1M, pH 8 100 mM 2 NaCl 5M 1,4M 3 EDTA 0,5M, PH 8 50 mM 4 CTAB 2% (w/v) 5 Nƣớc khử ion vô trùng Các bƣớc tiến hành:
(1) Nghiền mẫu lá trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ. Bột đã nghiền cho vào ống Eppendorf 1,5 ml. Thêm 700µl đệm tách, đảo đều và ủ ở 65oC trong 90 phút. (2) Bổ sung 700µl hỗn hợp Chloroform : Isoamyl alcohol (tỷ lệ 24:1) vào mỗi ống, đảo đều sau đó ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 15 phút.
(3) Hút 500 µl dịch nổi pha trên sang ống Eppendorf khác, bổ sung 500 µl isopropanol lạnh. Để mẫu trong tủ -20oC trong 30 phút.
(4) Ly tâm thu 13000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút để thu tủa DNA, sau đó rửa tủa bằng cồn 70oC.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
(5) Loại bỏ cồn, làm khô tủa ở điều kiện nhiệt độ phòng và hòa tan DNA trong nƣớc khử ion vô trùng và bảo quản ở -20o
C.
Phản ứ -
ến hành với các cặp mồi đặc hiệ 2.2). Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR bao gồm: biến tính ở 94oC trong 3 phút; chuỗi phản ứng 35 chu kỳ với biến tính ở 94oC trong 1 phút, gắn mồi ở 57o trong 45 giây, tổng hợp chuỗi polynucleotide ở 72oC; hoàn tất tổng hợp ở 72oC trong 5 phút và kết thúc
phản ứng ở 4oC. Sản phẩm PCR đƣợc điệ 0,8% và
chụp ảnh.
Bảng 2.3. Trình tự các cặp mồi đƣợc sử dụng trong nghiên cứu Trình tự SMV-CPi-Fi 5’- CACCGCAGCAGAAGCTTACA -3’ BYMV-CPi-Ri 5’- ATGTTCCGAACCCCAAGCAA -3’ Bảng 2.4.Thành phần của phản ứng PCR STT Thành phần Nồng độ 1 Nƣớc khử ion 8,6µl 2 Master Mix 12,5µl 3 SMV-CPi-Fi (10pmol/µl) 0,7µl 4 BYMV-CPi-Ri (10pmol/µl) 0,7µl 5 cDNA khuôn (10 – 20 ng/µl) 2,5µl Tổng thể tích 25µl
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2.2.6 gen. : = ới PCR (%)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
VI KHUẨN A. TUMEFACIENS
pK7GW-CPi (SMV-BYMV)
SMV và BYMV là hai loại virus gây nên bệnh khảm ở đậu tƣơng thuộc cùng nhóm potyvirrus, có hệ gen là RNA sợi đơn dƣơng và có triệu chứng rất khó phân biệt. Cây đậu tƣơng có thể chỉ bị nhiễm một loại virus hoặc SMV hoặc BYMV và cũng có thể nhiễm đồng thời cả hai loại virus này. Khi cây đậu tƣơng nhiễm đồng thời cả hai loài virus này thƣờng không gây chết cây, nhƣng sẽ ảnh hƣởng làm giảm năng suất và chất lƣợng .
Virus có kích thƣớc bộ gen rất nhỏ, mã hóa chỉ một số ít gen chịu trách nhiệm nhiều chức năng sống của virus, trong đó có 3 chức năng quan trọng là cấu trúc (lắp ráp phân tử virus), tái sinh, di chuyển (trong nội bộ tế bào, giữa các tế bào và hệ thống trong cây). Một trong các gen đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong nghiên cứu đa dạng và phân loại đối với virus thực vật là gen mã hóa protein vỏ (CP gen). Mặt khác, SMV và BYMV cùng thuộc nhóm potyvirus, chiếm tới 20% tổng số virus thực vật, đoạn gen
573 .
Để tạo ra các có khả năng kháng virus này, nhóm nghiên cứu đã ứng dụng kỹ thuật Gateway thiết kế thành công vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa CPi từ hai loài SMV và BYMV để đƣa vào hệ gen của thực vật. pK7GW-CPi (SMV-BYMV)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
BYMV [12].
Tiến hành biến nạp vector chuyển gen vào tế bào vi khuẩn A.tumefaciens
bằng phƣơng pháp xung điện. Sau đó, chọn 5
phản ứng colony-PCR với cặp mồi SMV-CPi-Fi/BYMV-CPi-Ri để kiểm tra các dòng khuẩn lạc có mang gen chuyển hay không,
- 3.1. 0,5kb 2kb 5kb M 1 2 3 4 5 M 1 2 3 4 5
Hình 3.1. Kết quả điệ ản phẩm colony-PCR
trực tiếp từ khuẩn lạc
(M: Thang DNA chuẩn 1kb (Thermo Scientific)
(1, 2, 3, 4, 5: Sản phẩm colony-PCR của 5 dòng khuẩn lạc)
Kết quả ở hình 3.1 cho thấ ột băng
điện di DNA có kích thƣớc khoảng 573bp, đúng bằng kích thƣớc của đoạn CPi (SMV-BYMV) nh ban đầu có thể kết luận rằng đã biến nạp thành công cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào tế bào A. tumafaciens và tạo đƣợc ẩn A. tumefaciens tái tổ hợp mang vector chuyển gen pK7GW-CPi (SMV-BYMV). Những dòng A. tumefaciens sau khi kiểm tra đƣợc lƣu giữ trong glycerol ở -84oC để phục vụ lây nhiễm vào mô tổn thƣơng nách lá mầm đậu tƣơng nhằm tạ ậu tƣơng chuyển gen kháng đồng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hiệu suất chuyển gen phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó có số chồi phát sinh trong mỗi mẫu biến nạp.
đã
2008. ầ
A B C D 3.2. Giai đoạn chuẩn bị mầm
; ;
; .
Hạt đậu tƣơng đƣợc Clo tro . Việc khử
trùng đƣợc thực hiện trong một bình kín đặt trong tủ hút. Khi
- làm nguyên liệu biến nạp
(Hình 3.2). Sau đó, tiến hành tách đôi lá mầm, loại đỉnh sinh trƣởng gây t
thƣơng (i) , (ii) (iii) ới kim
châm vào nách lá mầm của hai giống ĐT12 và DT2008 3.3
đánh giá ảnh hƣởng của phƣơng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của phƣơng thức gây tổn thƣơng nách lá mầm đến khả năng tạo đa chồi
Giống Công thức thí nghiệm Tổng số mẫu ẫ Số chồ Hiệu suất tạo đa chồi ĐT12 Không tổn thƣơng 30 0 1 0% Gây tổn thƣơng bằng dao 30 4,67 ± 0,33 1,65 ± 0,13 46,67% Gây tổn thƣơng bằng kim 30 5,33 ± 0,33 1,93 ± 0,07 53,33% Kết hợ 30 5,67 ± 0,33 2,41 ± 0,14 56,67% DT2008
Không gây tổn thƣơng 30 0,33 ± 0,33 1,03 ± 0,03 3,33% Gây tổn thƣơng bằng dao 30 6,00 ± 0,58 2,22 ± 0,04 60,00% Gây tổn thƣơng bằng kim 30 6,33 ± 0,33 2,48 ± 0,10 63,33% Kết hợ 30 7,00 ± 0,58 2,72 ± 0,08 70,00%
Kết quả bảng 3.1 cho thấy, thí nghiệm đối chứng không gây tổn thƣơng lá mầm gần nhƣ không có khả năng tạo đa chồi ở cả hai giống ĐT12 và DT2008. Tuy nhiên, khi tiến hành gây tổn thƣơng nách lá mầm bằng phƣơng pháp tổn thƣơng bằng dao, gây tổn thƣơng bằng kim và kết hợp tổn thƣơng bằng cả dao và kim thì tỷ lệ mẫu tạo đa chồi ở cả hai giống đã tăng lên dao động từ 4,67 ± 0,33 đến 7,00 ± 0,58 mẫu tạo đa chồi cho một lần thí nghiệm. Số chồi trên 1 mẫu dao động từ 1,65 ± 0,13 đến 2,72 ± 0,08. Về hiệu quả tạo đa
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
chồi, cả hai giống đều cho thấy phƣơng pháp gây tổn thƣơng kết hợp bằng dao và kim cho hiệu quả cao hơn (ĐT12 là 56,67% và DT2008 là 70%) so với phƣơng pháp gây tổn thƣơng bằng dao (46,67% với giống ĐT12 và 60% với giống DT2008) hay phƣơng pháp gây tổn thƣơng bằng kim (giống ĐT12 với 53,33% và giống DT2008 với 63,33%) với độ tin cậ 3.3).
Hình 3.3. Kết quả gây tổn thƣơng, tạo đa chồi nách lá mầm bằng các phƣơng thức khác nhau ở hai giống ĐT12 và DT2008
(A): Không gây tổn thương; (B): Gây tổn thương bằng dao;
(C): Gây tổn thương bằng kim nhọn; (D): Gây tổn thương kết hợp dao và kim
Hiện nay đã có nhiều tác giả nghiên cứu chuyển gen vào đậu tƣơng cũng sử dụng phƣơng pháp gây tổn thƣơng nách lá mầm nhằm tăng hiệu quả biến nạp. Xue và cs (2006) sử dụng hệ thống kim nhọn gây tổn thƣơng vào nách lá mầm, sau đó cho lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404 mang vector pGB chứa gen bar và gen gfp đã thu đƣợc hiệu quả chuyển gen là 8,9-15,1% [47]. Olhoft và cs (2003) sử dụng phƣơng pháp gây tổn thƣơng vào nách lá mầm thu đƣợc hiệu quả chuyển gen là 0,7-16,4% [32]. Kết quả
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
nhƣ nghiên cứu của các tác giả khác (Paz và cs, 2004; Trần Thị Cúc Hòa và cs, 2008) [34], [43]…
Theo Olhoft và cs (2006), Xue và cs (2006), Zhang và cs (1999) việc gây tổn thƣơng nách lá
[33], [48], [51]. Yamada và cs (2012) , sử dụng bàn chải làm từ thép không gỉ để tạo các vết thƣơng ở nách lá mầm thì không yêu cầu nhiều về mặt kỹ thuật và sự khéo léo [49]. Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng giống DT2008 là giống đậu tƣơng đột biến chịu hạn mới có khả năng sinh trƣởng khỏe, có nhiều ƣu điểm hơn so giống ĐT12 và kết quả thu đƣợc có hiệu suất tạo đa chồi cao hơn (đối với phƣơng thức gây tổn thƣơng bằng kết hợp kim và dao ĐT12 đạt hiệu suất 56,67%, DT2008 đạt 70%), số chồi/mẫu thu đƣợc nhiều hơn và khả năng sinh trƣởng tốt hơn (đối với phƣơng thức gây tổn thƣơng bằng kết hợp kim và dao ĐT12 có số chồi/mẫu 2,41 ± 0,14, DT2008 là 2,72 ± 0,08). , mức độ hình thành chồi ở nách lá mầm không chỉ phụ thuộc vào kỹ thuật gây tổn thƣơng mà còn phụ thuộc vào đặc điểm của kiểu gen cây đậu tƣơng. Điều này cho thấy khả năng tái sinh của giống có vai trò quan trọng trong thành công của mỗi phƣơng pháp chuyển gen. nghiên cứu, đánh giá khả năng tái sinh ở cây đậu tƣơng nhằm
tăng tỷ lệ đa chồi lên bằng cách loại bỏ chồi đỉnh Olhoft và cs (2011), Margie M. Paz và cs, 2005 đã tiến hành cái tiến phƣơng pháp nách lá mầm không qua giai đoạn nuôi cấy nảy mầm trƣớc khi lây nhiễm với vi khuẩn A. tumefaciens và đã rút ngắn đƣợc thời gian đồng thời nâng cao hiệu quả biến nạp [29], [31],...
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Từ kết quả thí nghiệm rằng, phƣơng pháp gây tổn thƣơng bằng kim kết hợp dao nhọn đã mang lại hiệu quả tạo đa chồi cao hơn so với phƣơng pháp chỉ gây tổn thƣơng bằ ổn thƣơng bằng kim, tạo tiền đề cho tăng hiệu quả biến nạp thông qua lây nhiễm vi khuẩn tái tổ hợp trong chuyển gen. Do đó, phƣơng pháp này đƣợc chúng tôi lựa chọn dùng cho
các thí nghiệ A. tumefaciens.
3.3.1. Tái sinh in vitro - đậu tương ĐT12 và DT2008
Chúng tôi tiến hành chuyển cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào h
2008 bằng kỹ thuật tái sinh đa chồ A. tumefaciens qua nách lá mầm hạt già ậu tƣơng dựa trên phƣơng pháp của Olhoft và cs (2001) có cải tiến s (2011) [7], [31].
ha
. Trong thí nghiệm này, chúng
tôi bố : ĐC0-
ển gen đƣợc cấy trên môi trƣờng tái sinh có bổ
- ển gen đƣợc cấy trên
môi trƣờng tái sinh không bổ sung kháng sinh. Kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.4 và bảng 3.2.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.4. Kết quả tái sinh và chuyển gen ở giống đậu tƣơng ĐT12 và DT2008
A – –
;
B - Cảm ứng tạo đa chồi trên SIM lần 1 (bổ sung BAP 2 mg/l + kanamycin 50 mg/l);
C – Cảm ứng tạo chồi trên SIM lần 2 trong 2 tuần (bổ sung BAP 2mg/l + kanamycin 75mg/l);
D - (bổ sung GA3 0,5 mg/l +
IAA0,1 mg/l + kanamycin50 mg/l);
E - ;
G - Ra cây (giá thể 1 trấu hun : 1 cát vàng); H – Ra cây trên bầu đất sạch dinh dưỡng
A
B C
D E
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ - - A. tumefaciens G Lô thí nghiệm Số mẫu biến nạp Số mẫu tạo đa chồi Số chồi kéo dài Số chồi ra rễ ĐT12 ĐC1 30 15 12 10 10 ĐC0 30 0 0 0 0 1 50 15 6 4 3 2 62 25 7 4 2 3 45 16 6 5 3 Tổng (1, 2, 3) 157 56 19 13 8 DT2008 ĐC1 30 21 19 16 16 ĐC0 30 0 0 0 0 1 55 22 15 11 7 2 60 25 19 10 8 3 75 36 20 17 10 Tổng (1, 2, 3) 190 83 54 38 25
Tiến hành t 7GW-CPi (SMV-BYMV) vào
157 19
. K gen đƣ 3.1
157 56 19 chồi kéo
dài trên môi trƣờng chọn lọc SEM chứa 50 mg/l kanamycin, trong đó13 chồi ra
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
.
190 83
54 ờng chọn lọc SEM chứa 50 mg/l
kanamycin, trong đó 38 chồi ra rễ, mang 25
.
Dựa trên số liệu thu đƣợc từ thí nghiệm (Bảng 3.2) chúng tôi
khả năng phát sinh chồi, kéo dài chồi, khả năng ra rễ giữa hai giống
ĐT12 và DT2008 , đƣợc hình 3.5
và bảng 3.3.
Bảng 3.3. Khả năng phát sinh chồi, kéo dài chồi và khả năng ra rễ của hai giống ĐT12 và DT2008 trong quá trình chuyển gen
Giống Tỷ lệ tạo đa chồi (%) Tỷ lệ chồi kéo dài (%) Tỷ lệ chồi ra rễ (%) Tỷ lệ số cây trồng trên giá thể (%) ĐT12 18,67 ± 3,18 6,33± 0,33 4,33 ± 0,33 2,67 ± 0,33 DT2008 27,67 ± 4,25 18,00 ± 1,52 12,67 ± 2,18 8,33 ± 0,88
Kết quả thể hiện ở bảng 3.3 cho thấy trong quá trình chuyển gen kết quả thu đƣợc qua mỗi giai đoạn tạo đa chồi, kéo dài chồi, ra rễ ở hai giống đậu tƣơng ĐT12 và DT2008 có sự khác nhau rõ . Giống ĐT12 có tỷ lệ tạo đa chồi trung bình 18,67%, còn giống DT2008 27,67%; tỷ lệ chồi kéo dài trung bình ở ĐT12 là 6,33% DT2008 là 18,00%; và tỷ lệ chồi ra rễ trung bình của giống ĐT12 là 4,33%, DT2008 là 12,67%. Nhìn chung giữa hai giống thí nghiệm thì DT2008 đem lại hiệu quả chuyển gen cao hơn so với ĐT12. Kết
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
quả đem lại tỷ lệ số cây trồng trên giá thể trung bình của giống ĐT12 DT2008 8,33%.
Hình 3.5. Kết quả tỷ lệ tạo đa chồi, kéo dài chồi và đƣa cây ra giá thể
(A)Giai đoạn tạo đa chồi; (B) Giai đoạn kéo dài chồi; (C) Giai đoạn đưa cây trồng ra ngoài giá thể
Để đánh giá đƣợc hiệu suất chuyển gen Nguyễn Thu Hiền và cộng sự (2011) đã tiến hành chuyển gen gus trên hai giống đậu tƣơng ĐT12 và DT84, sau khi nhuộm và kiểm tra cho thấy hiệu suất chuyển gen ở giai đoạn hạt có sự khác nhau (7,8% đối với giống ĐT12 và 4,3% với giống DT84) [7]. Điều này cho thấy rằng đặc điểm, nguồn gốc hay kiểu gen của giố ảnh hƣởng tớ
thành công của quá trình chuyể .
. Ở phƣơng pháp chuyển gen trực tiếp, gen đƣợc chuyển trực tiếp vào tế bào thực vật thông qua những thiết bị hoặc thao tác nhất định mà không cần nhờ những sinh vật trung gian. Tuy nhiên, tất cả các phƣơng pháp chuyển gen trực tiếp đòi hỏi kỹ thuật cao, chính
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ A.tumefaciens
hơn [2].
Đối với nghiên cứu chuyển gen gián tiếp ở thực vật, chủng A. tumefaciens và A. rhizogens đƣợc sử dụng phổ biến do hai loài này có khả năng xâm nhiễm qua vết thƣơng của hầu hết các loài thực vật hai lá mầm và một số ít các loài thực vật một lá mầm. Kết quả là gây ra những khối u hay hình thành lông rễ tơ theo cơ chế tự nhiên. Trong đó vi khuẩn A. tumefaciens đƣợc sử dụng rộng rãi hơn cả vì phƣơng pháp này dễ sử dụng, ít tốn kém nhƣng vẫn mang lại hiệu quả, thuận lợi cho việc phân tích cây chuyển gen và không gây tổn thƣơng tế bào [2].
0
DNA tổng số từ 5 dòng đậu tƣơng của giống ĐT12 và 20 dòng đậu tƣơng
của giống tra trên gel agarose.
Hình 3.6 ổng số tách từ T12 (1-5 2008 (6-25) Kết quả thể hiệ 3.6 có cao (SMV-BYMV) tro . 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 33 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 33
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
-
cây
gen CPi (SMV-BYMV) . K
(SM - 5
12 3.7 2 oạn
DNA thu đƣợc có kích thƣớc khoảng 573 bp 5.
3.7 ện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của cấ
- ậu tương chuyể 12
1-5: 5 dòng đậu tương ĐT12 chuyển gen; M: Marker 50 bp (Thermo Scientific)
12 đƣ : T12-03, T12-5. Kết quả này cho thấy cấu trúc pK7GW-CPi (SMV-BYMV) đã chuyển thành công vào giống đậu tƣơng ĐT12.
-
20 cây 2008 0
đƣợc thể hiện trên hình 3.8. Trên hình ảnh cho thấy xuất hiện
khoảng 5 DT2008 n
gen.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/