Tạo vi khuẩn A.tumefaciens tái tổ hợp bằng cách biến nạp pK7GW- Cpi(SMV-BYMV) vào tế bào A. tumefaciens CV58C1 pGV2260 bằng xung điện.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Phương pháp tạo tế bào khả biến A. tumefaciens
(1) Làm mới giống trên môi trƣờng LB đặc, sau đó nuôi lắc một khuẩn lạc trong 2ml môi trƣờng LB lỏng ở 28o
C trong 6 giờ.
(2) Lấy 100 l dung dịch vi khuẩn nuôi cấy tiếp ở 28oC trong tối 2 ngày trong 100ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh chọn lọc đến khi OD600nm = 1 - 1,5. (3) Làm lạnh mẫu trong đá 15 phút, ly tâm 5.000 vòng/phút trong 10 phút để thu cặn tế bào. Rửa cặn hai lần trong 10ml 1mM HEPES (N-2- hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid) pH 7,0.
(4) Cặn tế bào hoà tan trong 500-700 l 10% glycerol. Chia 45 l dịch tế bào vào mỗi ống Eppendorf, làm lạnh trong nitơ lỏng và giữ chủng ở -85oC.
Khi đã có đƣợc tế bào khả biến A. tumefaciens, tiến hành biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào bằng phƣơng pháp xung điện.
Quy trình biến nạp bằng xung điện
(1) Tế bào khả biến đƣợc đặt trong đá 5 phút, sau đó bổ sung 1µl pK7GW-Cpi (/SMV-BYMV) vào tế bào khả biến và trộn nhẹ.
(2) Chuyển tất cả hỗn hợp dịch A. tumefaciens + pK7GW-Cpi (SMV-BYMV) vào cuvet (đã đƣợc rửa bằng cồn 100o
và tráng lại bằng nƣớc khử ion, thấm khô và khử trùng bằng UV).
(3) Xung điện ở 2,5 kv, 25µF và 400Ω sau đó đặt ngay vào đá, sau 5 phút bổ sung 1 ml YEB (hoặc LB lỏng).
(4) Chuyển sang ống Eppendorft 2 ml nuôi ở 28oC trong 1 giờ trên máy lắc. (5) Chuyển 300 µl vào các đĩa chọn lọc chứa kháng sinh streptomycine 40 mg/l, spectinomycine 100 mg/l và rifamycin 50 mg/l, ủ ở 28oC –ừ 24 - 48 giờ.
Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng
tham khảo theo phƣơng pháp gây tổn thƣơng của Xue và cs (2006) [47]. T bố trí ngẫ 3 lần
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
nhắc lại, mỗi công thức theo dõi 6 đĩa,
số chồ .
Công thức thí nghiệm
CT1: Không gây tổn thƣơng (đối chứng) CT2: Gây tổn thƣơng bằng dao
CT3: Gây tổn thƣơng bằng kim
CT4: Gây tổn thƣơng kết hợp dao và kim
2.2.3. Phƣơng pháp tái sinh cây đậu tƣơng từ nách lá mầm
Tái sinh cây đậu tƣơng từ nách lá mầm đƣợc thực hiện theo môi trƣờng tái sinh của Nguyễn Thu Hiền và cs (2011) [7]. Các môi trƣờng đều đƣợc chuẩn pH và khử trùng (Bảng 2.1). Thí nghiệm đƣợc tiến hành ở nhiệt độ 25 ± 20C, cƣờng độ chiếu sáng 200x, thời gian chiếu sáng 16 giờ sáng/ ngày.
2.2.4. Phƣơng pháp lây nhiễm và tạo cây đậu tƣơng chuyển gen
Kỹ thuật tái sinh cây đậu tƣơng qua đa chồi từ nách lá mầm hạt chín đƣợc tiến hành dựa trên phƣơng pháp của Olhoft và cs (2001)
(2011) có cải tiến 2.2) [7], [31]. Thành phần các loại môi trƣờng sử dụng cho tái sinh cây qua đa chồi từ nách lá mầm hạt chín đƣợc chỉ ra trong bảng 2.8.
Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Các thí nghiệm của phần nuôi cây mô tế bào thực vật đựơc thực hiện trong phòng nuôi cây với điều kiện chiếu sáng theo quang chu kì 16 giờ sáng và 8giờ tối, nhiệt độ phòng 250C ± 2, cƣờng độ chiếu sáng 200x.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 2.1. Thành phần các loại môi trƣờng tái sinh in vitro
Loại môi trƣờng Kí hiệu Thành phần
Nảy mầm hạt (Germination medium)
GM Muối B5 (3,052 g/l )+ sucrose (20 g/l) + agar (6 g/l), pH = 5,8
Bổ sung: vitamin B5(1 mg/l) Đồng nuôi cấy
(Co-cultivation medium)
CCM Muối B5 (0,316 g/l)+ MES (3,9 g/l) + sucrose (30 g/l )+ agar (5 g/l), pH = 5,4
Bổ sung: vitamin B5 (1 mg/l )+ AS (0,2 mM) + L-cysteine (400 mg/l) + Sodium thiosulfate(158 mg/l) + DTT (154 mg/l )+ GA3(0,25 mg/l) + BAP Cảm ứng tạo đa chồi (Shoot induction medium)
SIM Muối B5(3,052 g/l) + MES (0,59 g/l) + sucrose (30 g/l), pH = 5,6
Bổ sung: vitamin B5 (1 mg/l )+ BAP + kháng sinh
Kéo dài chồi (Shoot elongation medium)
SEM MS (4,3 g/l) + MES( 0,59 g/l )+ sucrose (30 g/l) + agar (6 g/l), pH = 5,6
Bổ sung: vitamin B5 1 mg/l + L-asparagine (50 mg/l) + L-pyroglutamic acid (100 mg/l )+ IAA + GA3 Ra rễ (Rooting medium) RM MS (1,58 g/l) + MES (0,59 g/l )+ sucrose (20 g/l) + agar (6 g/l), pH = 5,6
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm tái sinh và chuyển gen vào cây đậu tƣơng [7]
2.2.4.1. Tạo nguyên liệ ảm ứng tạo đa chồi
Hạt chín sau khi bỏ các hạt kém chất lƣợng đƣợc tiến hành khử trùng
bằ ủ hốt. Sau khi khử trùng, cho hạt nảy mầm trên
môi trƣờng GM, sau 4-5 ngày cắt lấy phần lá mầm, tách đôi hai lá mầm, loại đỉnh sinh trƣởng. Phần lá mầm còn lại đƣợc đặt lên môi trƣờng cảm ứng tạo đa chồi (SIM). Theo dõi tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi, số chồi trung bình /cụm sau thời gian cảm ứng là 4 tuần để đánh giá khả năng tạo đa chồi của giống đậu tƣơng cũng nhƣ mức độ phù hợp của môi trƣờng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2.2.4.2. Kéo dài chồ ỉnh
Các cụm chồi đƣợc tạo ra từ quá trình nuôi cấy trên môi trƣờng SIM đƣợc chuyển sang môi trƣờng kéo dài chồi SEM. Đánh giá khả năng kéo dài của chồi sau 2 tuần dựa trên việc theo dõi và thống kê số chồi kéo dài/cụm nuôi cấy cũng nhƣ chất lƣợng chồi.
Khi các chồi đạt chiều cao từ 4-5 cm, chọn những chồi khỏe chuyển sang môi trƣờng ra rễ RM. Khi cây in vitro có 3 lá, có bộ rễ đảm bảo (thƣờng sau 2 tuần nuôi cấy) sẽ thực hiện việc ra cây. Cây đƣợc lấy ra khỏi bình nuôi cấy một cách nhẹ nhàng, rửa sạch phần agar bám quanh gốc và rễ, sau đó cây đƣợc đặt trên giá thể ra cây. Cây sống sót trên giá thể đƣợc đƣa ra trồng trên chậu đất có bổ sung phân bón và trồng trong điều kiện nhà lƣới.
2.2.4.3. Chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens qua nách lá mầm của hạt
Phƣơng pháp chuyển gen thông qua nách lá mầm đƣợc tiến hành dựa trên nghiên cứu của Olhoft và cs (2001) có cải tiến (Hình 2.6) [31].
Hạt đậu tƣơng chín sau khi đƣợc khử trùng, nảy mầm, tách và thu phần lá mầm (tƣơng tự nhƣ tạo nguyên liệu nuôi cấy in vitro trong quy trình tái sinh cây) sẽ đƣợc gây tổn thƣơng bằng mũi dao nhọn từ 7-8 lần vào phần nách lá mầm. Lá
mầ ổ ễm khuẩn Agrobacterium .
Mẫu đƣợc ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn có OD600 đạt 0,6-1trong thời gian 30 phút. Sau thời gian nhiễm khuẩn, mẫu đƣợc chuyển sang môi trƣờng đồng nuôi cấy CCM đặc. Quá trình đồng nuôi cấy diễn ra trong tối, ở 250C trong thời gian là 5 ngày.
Sau thời gian đồng nuôi cấy, mẫu biến nạp đƣợc lắc trong môi trƣờ (SIM) có bổ sung 500 mg/l cefotaxim với thời gian là 10 phút, sau đó thấm khô bằng giấy thấm khử trùng. Cắt bỏ chồi chính trên các mảnh lá mầ ấy mẫu lên môi trƣờng tạo cụm chồi có bổ sung 500 mg/l cefotaxim. Sau thời gian 2 tuần, mẫu đƣợc chuyển sang môi trƣờng SIM đặc có
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
, các cụm chồi sống đƣợc trên môi trƣờng chọn lọc sẽ đƣợc chuyển sang môi trƣờng phát triển chồi (SEM) có bổ
. Khi các chồi phát triển đạt kích thƣớc từ 3-5 cm sẽ đƣợc chuyển sang môi trƣờng ra rễ (RM) có bổ sung 250 mg/l cefotaxim để tạo cây hoàn chỉnh.
2.2.5
DNA tổng số từ các mẫu lá non đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp của Saghai Maroof và cộng sự (1984) [38] có cải tiến, với thành phần đệm chiết ở bảng 2.2. Bảng 2.2. Thành phần đệm tách DNA tổng số STT Nồng độ gốc Nồng độ sử dụng 1 Tris-HCl 1M, pH 8 100 mM 2 NaCl 5M 1,4M 3 EDTA 0,5M, PH 8 50 mM 4 CTAB 2% (w/v) 5 Nƣớc khử ion vô trùng Các bƣớc tiến hành:
(1) Nghiền mẫu lá trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ. Bột đã nghiền cho vào ống Eppendorf 1,5 ml. Thêm 700µl đệm tách, đảo đều và ủ ở 65oC trong 90 phút. (2) Bổ sung 700µl hỗn hợp Chloroform : Isoamyl alcohol (tỷ lệ 24:1) vào mỗi ống, đảo đều sau đó ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 15 phút.
(3) Hút 500 µl dịch nổi pha trên sang ống Eppendorf khác, bổ sung 500 µl isopropanol lạnh. Để mẫu trong tủ -20oC trong 30 phút.
(4) Ly tâm thu 13000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút để thu tủa DNA, sau đó rửa tủa bằng cồn 70oC.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
(5) Loại bỏ cồn, làm khô tủa ở điều kiện nhiệt độ phòng và hòa tan DNA trong nƣớc khử ion vô trùng và bảo quản ở -20o
C.
Phản ứ -
ến hành với các cặp mồi đặc hiệ 2.2). Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR bao gồm: biến tính ở 94oC trong 3 phút; chuỗi phản ứng 35 chu kỳ với biến tính ở 94oC trong 1 phút, gắn mồi ở 57o trong 45 giây, tổng hợp chuỗi polynucleotide ở 72oC; hoàn tất tổng hợp ở 72oC trong 5 phút và kết thúc
phản ứng ở 4oC. Sản phẩm PCR đƣợc điệ 0,8% và
chụp ảnh.
Bảng 2.3. Trình tự các cặp mồi đƣợc sử dụng trong nghiên cứu Trình tự SMV-CPi-Fi 5’- CACCGCAGCAGAAGCTTACA -3’ BYMV-CPi-Ri 5’- ATGTTCCGAACCCCAAGCAA -3’ Bảng 2.4.Thành phần của phản ứng PCR STT Thành phần Nồng độ 1 Nƣớc khử ion 8,6µl 2 Master Mix 12,5µl 3 SMV-CPi-Fi (10pmol/µl) 0,7µl 4 BYMV-CPi-Ri (10pmol/µl) 0,7µl 5 cDNA khuôn (10 – 20 ng/µl) 2,5µl Tổng thể tích 25µl
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2.2.6 gen. : = ới PCR (%)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
VI KHUẨN A. TUMEFACIENS
pK7GW-CPi (SMV-BYMV)
SMV và BYMV là hai loại virus gây nên bệnh khảm ở đậu tƣơng thuộc cùng nhóm potyvirrus, có hệ gen là RNA sợi đơn dƣơng và có triệu chứng rất khó phân biệt. Cây đậu tƣơng có thể chỉ bị nhiễm một loại virus hoặc SMV hoặc BYMV và cũng có thể nhiễm đồng thời cả hai loại virus này. Khi cây đậu tƣơng nhiễm đồng thời cả hai loài virus này thƣờng không gây chết cây, nhƣng sẽ ảnh hƣởng làm giảm năng suất và chất lƣợng .
Virus có kích thƣớc bộ gen rất nhỏ, mã hóa chỉ một số ít gen chịu trách nhiệm nhiều chức năng sống của virus, trong đó có 3 chức năng quan trọng là cấu trúc (lắp ráp phân tử virus), tái sinh, di chuyển (trong nội bộ tế bào, giữa các tế bào và hệ thống trong cây). Một trong các gen đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong nghiên cứu đa dạng và phân loại đối với virus thực vật là gen mã hóa protein vỏ (CP gen). Mặt khác, SMV và BYMV cùng thuộc nhóm potyvirus, chiếm tới 20% tổng số virus thực vật, đoạn gen
573 .
Để tạo ra các có khả năng kháng virus này, nhóm nghiên cứu đã ứng dụng kỹ thuật Gateway thiết kế thành công vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa CPi từ hai loài SMV và BYMV để đƣa vào hệ gen của thực vật. pK7GW-CPi (SMV-BYMV)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
BYMV [12].
Tiến hành biến nạp vector chuyển gen vào tế bào vi khuẩn A.tumefaciens
bằng phƣơng pháp xung điện. Sau đó, chọn 5
phản ứng colony-PCR với cặp mồi SMV-CPi-Fi/BYMV-CPi-Ri để kiểm tra các dòng khuẩn lạc có mang gen chuyển hay không,
- 3.1. 0,5kb 2kb 5kb M 1 2 3 4 5 M 1 2 3 4 5
Hình 3.1. Kết quả điệ ản phẩm colony-PCR
trực tiếp từ khuẩn lạc
(M: Thang DNA chuẩn 1kb (Thermo Scientific)
(1, 2, 3, 4, 5: Sản phẩm colony-PCR của 5 dòng khuẩn lạc)
Kết quả ở hình 3.1 cho thấ ột băng
điện di DNA có kích thƣớc khoảng 573bp, đúng bằng kích thƣớc của đoạn CPi (SMV-BYMV) nh ban đầu có thể kết luận rằng đã biến nạp thành công cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào tế bào A. tumafaciens và tạo đƣợc ẩn A. tumefaciens tái tổ hợp mang vector chuyển gen pK7GW-CPi (SMV-BYMV). Những dòng A. tumefaciens sau khi kiểm tra đƣợc lƣu giữ trong glycerol ở -84oC để phục vụ lây nhiễm vào mô tổn thƣơng nách lá mầm đậu tƣơng nhằm tạ ậu tƣơng chuyển gen kháng đồng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hiệu suất chuyển gen phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó có số chồi phát sinh trong mỗi mẫu biến nạp.
đã
2008. ầ
A B C D 3.2. Giai đoạn chuẩn bị mầm
; ;
; .
Hạt đậu tƣơng đƣợc Clo tro . Việc khử
trùng đƣợc thực hiện trong một bình kín đặt trong tủ hút. Khi
- làm nguyên liệu biến nạp
(Hình 3.2). Sau đó, tiến hành tách đôi lá mầm, loại đỉnh sinh trƣởng gây t
thƣơng (i) , (ii) (iii) ới kim
châm vào nách lá mầm của hai giống ĐT12 và DT2008 3.3
đánh giá ảnh hƣởng của phƣơng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của phƣơng thức gây tổn thƣơng nách lá mầm đến khả năng tạo đa chồi
Giống Công thức thí nghiệm Tổng số mẫu ẫ Số chồ Hiệu suất tạo đa chồi ĐT12 Không tổn thƣơng 30 0 1 0% Gây tổn thƣơng bằng dao 30 4,67 ± 0,33 1,65 ± 0,13 46,67% Gây tổn thƣơng bằng kim 30 5,33 ± 0,33 1,93 ± 0,07 53,33% Kết hợ 30 5,67 ± 0,33 2,41 ± 0,14 56,67% DT2008
Không gây tổn thƣơng 30 0,33 ± 0,33 1,03 ± 0,03 3,33% Gây tổn thƣơng bằng dao 30 6,00 ± 0,58 2,22 ± 0,04 60,00% Gây tổn thƣơng bằng kim 30 6,33 ± 0,33 2,48 ± 0,10 63,33% Kết hợ 30 7,00 ± 0,58 2,72 ± 0,08 70,00%
Kết quả bảng 3.1 cho thấy, thí nghiệm đối chứng không gây tổn thƣơng lá mầm gần nhƣ không có khả năng tạo đa chồi ở cả hai giống ĐT12 và DT2008. Tuy nhiên, khi tiến hành gây tổn thƣơng nách lá mầm bằng phƣơng pháp tổn thƣơng bằng dao, gây tổn thƣơng bằng kim và kết hợp tổn thƣơng bằng cả dao và kim thì tỷ lệ mẫu tạo đa chồi ở cả hai giống đã tăng lên dao động từ 4,67 ± 0,33 đến 7,00 ± 0,58 mẫu tạo đa chồi cho một lần thí nghiệm. Số chồi trên 1 mẫu dao động từ 1,65 ± 0,13 đến 2,72 ± 0,08. Về hiệu quả tạo đa
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
chồi, cả hai giống đều cho thấy phƣơng pháp gây tổn thƣơng kết hợp bằng dao và kim cho hiệu quả cao hơn (ĐT12 là 56,67% và DT2008 là 70%) so với phƣơng pháp gây tổn thƣơng bằng dao (46,67% với giống ĐT12 và 60% với giống DT2008) hay phƣơng pháp gây tổn thƣơng bằng kim (giống ĐT12 với 53,33% và giống DT2008 với 63,33%) với độ tin cậ 3.3).
Hình 3.3. Kết quả gây tổn thƣơng, tạo đa chồi nách lá mầm bằng các phƣơng thức khác nhau ở hai giống ĐT12 và DT2008
(A): Không gây tổn thương; (B): Gây tổn thương bằng dao;
(C): Gây tổn thương bằng kim nhọn; (D): Gây tổn thương kết hợp dao và kim
Hiện nay đã có nhiều tác giả nghiên cứu chuyển gen vào đậu tƣơng cũng sử dụng phƣơng pháp gây tổn thƣơng nách lá mầm nhằm tăng hiệu quả biến nạp. Xue và cs (2006) sử dụng hệ thống kim nhọn gây tổn thƣơng vào nách lá mầm, sau đó cho lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404 mang vector pGB chứa gen bar và gen gfp đã thu đƣợc hiệu quả chuyển gen là 8,9-15,1% [47]. Olhoft và cs (2003) sử dụng phƣơng pháp gây tổn thƣơng vào nách lá mầm thu đƣợc hiệu quả chuyển gen là 0,7-16,4% [32]. Kết quả
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
nhƣ nghiên cứu của các tác giả khác (Paz và cs, 2004; Trần Thị Cúc Hòa và cs, 2008) [34], [43]…
Theo Olhoft và cs (2006), Xue và cs (2006), Zhang và cs (1999) việc gây tổn thƣơng nách lá
[33], [48], [51]. Yamada và cs (2012) , sử dụng bàn chải làm từ thép không gỉ để tạo các vết thƣơng ở nách lá mầm thì không yêu cầu nhiều về mặt kỹ thuật và sự khéo léo [49]. Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng giống DT2008 là giống đậu tƣơng đột biến chịu hạn mới có khả năng sinh trƣởng khỏe, có nhiều ƣu điểm hơn so giống ĐT12 và kết quả thu đƣợc có hiệu suất tạo đa chồi cao hơn (đối với phƣơng thức gây tổn thƣơng bằng kết hợp kim và dao ĐT12 đạt hiệu suất 56,67%, DT2008 đạt 70%), số chồi/mẫu thu đƣợc nhiều hơn và khả năng sinh trƣởng tốt hơn (đối với phƣơng thức gây tổn thƣơng bằng kết hợp kim và dao ĐT12 có số chồi/mẫu 2,41 ± 0,14, DT2008 là 2,72 ± 0,08). , mức độ hình thành chồi ở nách lá mầm không chỉ phụ thuộc vào kỹ thuật gây tổn thƣơng mà còn phụ thuộc vào đặc điểm của kiểu gen cây đậu tƣơng. Điều này cho thấy