Kỹ thuật tái sinh cây đậu tƣơng qua đa chồi từ nách lá mầm hạt chín đƣợc tiến hành dựa trên phƣơng pháp của Olhoft và cs (2001)
(2011) có cải tiến 2.2) [7], [31]. Thành phần các loại môi trƣờng sử dụng cho tái sinh cây qua đa chồi từ nách lá mầm hạt chín đƣợc chỉ ra trong bảng 2.8.
Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Các thí nghiệm của phần nuôi cây mô tế bào thực vật đựơc thực hiện trong phòng nuôi cây với điều kiện chiếu sáng theo quang chu kì 16 giờ sáng và 8giờ tối, nhiệt độ phòng 250C ± 2, cƣờng độ chiếu sáng 200x.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 2.1. Thành phần các loại môi trƣờng tái sinh in vitro
Loại môi trƣờng Kí hiệu Thành phần
Nảy mầm hạt (Germination medium)
GM Muối B5 (3,052 g/l )+ sucrose (20 g/l) + agar (6 g/l), pH = 5,8
Bổ sung: vitamin B5(1 mg/l) Đồng nuôi cấy
(Co-cultivation medium)
CCM Muối B5 (0,316 g/l)+ MES (3,9 g/l) + sucrose (30 g/l )+ agar (5 g/l), pH = 5,4
Bổ sung: vitamin B5 (1 mg/l )+ AS (0,2 mM) + L-cysteine (400 mg/l) + Sodium thiosulfate(158 mg/l) + DTT (154 mg/l )+ GA3(0,25 mg/l) + BAP Cảm ứng tạo đa chồi (Shoot induction medium)
SIM Muối B5(3,052 g/l) + MES (0,59 g/l) + sucrose (30 g/l), pH = 5,6
Bổ sung: vitamin B5 (1 mg/l )+ BAP + kháng sinh
Kéo dài chồi (Shoot elongation medium)
SEM MS (4,3 g/l) + MES( 0,59 g/l )+ sucrose (30 g/l) + agar (6 g/l), pH = 5,6
Bổ sung: vitamin B5 1 mg/l + L-asparagine (50 mg/l) + L-pyroglutamic acid (100 mg/l )+ IAA + GA3 Ra rễ (Rooting medium) RM MS (1,58 g/l) + MES (0,59 g/l )+ sucrose (20 g/l) + agar (6 g/l), pH = 5,6
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm tái sinh và chuyển gen vào cây đậu tƣơng [7]
2.2.4.1. Tạo nguyên liệ ảm ứng tạo đa chồi
Hạt chín sau khi bỏ các hạt kém chất lƣợng đƣợc tiến hành khử trùng
bằ ủ hốt. Sau khi khử trùng, cho hạt nảy mầm trên
môi trƣờng GM, sau 4-5 ngày cắt lấy phần lá mầm, tách đôi hai lá mầm, loại đỉnh sinh trƣởng. Phần lá mầm còn lại đƣợc đặt lên môi trƣờng cảm ứng tạo đa chồi (SIM). Theo dõi tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi, số chồi trung bình /cụm sau thời gian cảm ứng là 4 tuần để đánh giá khả năng tạo đa chồi của giống đậu tƣơng cũng nhƣ mức độ phù hợp của môi trƣờng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2.2.4.2. Kéo dài chồ ỉnh
Các cụm chồi đƣợc tạo ra từ quá trình nuôi cấy trên môi trƣờng SIM đƣợc chuyển sang môi trƣờng kéo dài chồi SEM. Đánh giá khả năng kéo dài của chồi sau 2 tuần dựa trên việc theo dõi và thống kê số chồi kéo dài/cụm nuôi cấy cũng nhƣ chất lƣợng chồi.
Khi các chồi đạt chiều cao từ 4-5 cm, chọn những chồi khỏe chuyển sang môi trƣờng ra rễ RM. Khi cây in vitro có 3 lá, có bộ rễ đảm bảo (thƣờng sau 2 tuần nuôi cấy) sẽ thực hiện việc ra cây. Cây đƣợc lấy ra khỏi bình nuôi cấy một cách nhẹ nhàng, rửa sạch phần agar bám quanh gốc và rễ, sau đó cây đƣợc đặt trên giá thể ra cây. Cây sống sót trên giá thể đƣợc đƣa ra trồng trên chậu đất có bổ sung phân bón và trồng trong điều kiện nhà lƣới.
2.2.4.3. Chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens qua nách lá mầm của hạt
Phƣơng pháp chuyển gen thông qua nách lá mầm đƣợc tiến hành dựa trên nghiên cứu của Olhoft và cs (2001) có cải tiến (Hình 2.6) [31].
Hạt đậu tƣơng chín sau khi đƣợc khử trùng, nảy mầm, tách và thu phần lá mầm (tƣơng tự nhƣ tạo nguyên liệu nuôi cấy in vitro trong quy trình tái sinh cây) sẽ đƣợc gây tổn thƣơng bằng mũi dao nhọn từ 7-8 lần vào phần nách lá mầm. Lá
mầ ổ ễm khuẩn Agrobacterium .
Mẫu đƣợc ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn có OD600 đạt 0,6-1trong thời gian 30 phút. Sau thời gian nhiễm khuẩn, mẫu đƣợc chuyển sang môi trƣờng đồng nuôi cấy CCM đặc. Quá trình đồng nuôi cấy diễn ra trong tối, ở 250C trong thời gian là 5 ngày.
Sau thời gian đồng nuôi cấy, mẫu biến nạp đƣợc lắc trong môi trƣờ (SIM) có bổ sung 500 mg/l cefotaxim với thời gian là 10 phút, sau đó thấm khô bằng giấy thấm khử trùng. Cắt bỏ chồi chính trên các mảnh lá mầ ấy mẫu lên môi trƣờng tạo cụm chồi có bổ sung 500 mg/l cefotaxim. Sau thời gian 2 tuần, mẫu đƣợc chuyển sang môi trƣờng SIM đặc có
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
, các cụm chồi sống đƣợc trên môi trƣờng chọn lọc sẽ đƣợc chuyển sang môi trƣờng phát triển chồi (SEM) có bổ
. Khi các chồi phát triển đạt kích thƣớc từ 3-5 cm sẽ đƣợc chuyển sang môi trƣờng ra rễ (RM) có bổ sung 250 mg/l cefotaxim để tạo cây hoàn chỉnh.