Hệ thống tái sinh
Hai giai đoạn biến nạp và tái sinh cây cùng có ý nghĩa quan trọng và quyết định đến thành công của một thí nghiệm chuyển gen. Nếu quá trình biến nạp xảy ra mà tế bào không tái sinh đƣợc thành cây hoặc sự tái sinh diễn ra mà không có sự biến nạp thì thí nghiệm chuyển gen chƣa thành công [2].
Các yêu cầu cơ bản đối với hệ thống tái sinh cây
Các phƣơng pháp chuyển gen đều chuyển gen vào các tế bào hay mô, nói cách khác tế bào và mô là đơn vị tiếp nhận gen mới. Do vậy, các mẫu tế bào, mô dùng cho quá trình chuyển gen cần phải có khả năng phân chia in vitro nhanh, phải có khả năng tiếp nhận gen mới. Các loại mô đƣợc sử dụng trong hệ thống tái sinh nhƣ phôi non, phôi trƣởng thành; Mô sẹo có nguồn gốc từ các bộ phận khác nhau ở cơ thể thực vật; Mô lá, thân mầm.
Quy trình tái sinh cây phải có hiệu quả cao, không hoặc ít phụ thuộc vào kiểu gen.
Cây tái sinh có tỷ lệ sống cao (khi đƣa ra ngoài đất trồng), tần số biến dị thấp và khả năng hữu thụ cao để có thể sử dụng làm nguồn nguyên liệu ban đầu nhằm tiếp tục tiến hành các thí nghiệm ở các thế hệ tiếp theo.
Nhƣ vậy, có thể thấy hoàn thiện hệ thống tái sinh là điều kiện tiên quyết để thực hiện thành công quá trình biến nạp gen ở thực vật.
Tính toàn năng của tế bào thực vật đã tạo điều kiện cho sự tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro qua quá trình phát sinh cơ quan (hình thành chồi) hay phát sinh phôi khi chúng đƣợc nuôi cấy trong điều kiện dinh dƣỡng thích hợp và bổ sung các chất kích thích sinh trƣởng cần thiết. Các chồi bất định hay phôi đƣợc hình thành từ các tế bào đơn đƣợc hoạt hóa là những bộ phận dễ dàng tiếp nhận
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
sự biến nạp và có khả năng cho những cây biến nạp hoàn chỉnh (không có tính khảm).
Tái sinh ở thực vật thông qua hai con đƣờng: Phát sinh cơ quan (organogensis) có thể xảy ra do sự phát triển chồi trực tiếp từ mẫu mô nuôi cấy [17] hoặc qua giai đoạn tạo mô sẹo còn gọi là sự phát sinh chồi từ mô sẹo và con đƣờng thứ hai là hình thành phôi soma (embryogensis), thƣờng có một tế bào hoặc một cụm nhỏ các tế bào diễn ra phản biệt hóa để tạo phôi soma (phôi vô tính) phát triển thành cây hoàn chỉnh tƣơng tự nhƣ phôi hữu tính (phôi zygotic) [15], [18].
Hình thành phôi soma là một giai đoạn quan trọng đối với quá trình tái sinh ở thực vật trong hệ thống nuôi cấy tế bào in vitro [35]. Phôi soma là kết quả của một quá trình phát triển từ các tế bào soma thành những cấu trúc tƣơng tự nhƣ phôi hữu tính thông qua các giai đoạn phát triển đặc trƣng là hình cầu, hình tim, hình ngƣ lôi, mọc lá mầm và trƣởng thành. Hệ thống tái sinh cây thông qua phôi soma đƣợc sử dụng phổ biến trong nuôi cấy in vitro do khả năng tái sinh cây khá cao và sự xuất hiện của cây khảm có thể đƣợc giảm đáng kể [15].
Phƣơng thức tái sinh cây thông qua giai đoạn mô sẹo phụ thuộc vào nguồn gốc mô sẹo. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng mô sẹo dạng phôi có nguồn gốc từ đỉnh sinh trƣởng có tỷ lệ tái sinh cây cao hơn. Ngoài ra khả năng tái sinh cây cũng chịu ảnh hƣởng lớn bởi thành phần và nồng độ các chất kích thích sinh trƣởng thực vật đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy.
Phần lớn thực vật đƣợc tái sinh dễ dàng bằng con đƣờng nuôi cấy mô tế bào. Từ một tế bào biến nạp có thể tạo ra một cây chuyển gen, trong đó mỗi tế bào mang DNA ngoại lai và tiếp tục chuyển cho thế hệ sau sau khi nở hoa và tạo hạt [24].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hệ thống chọn lọc
Trong các quá trình chuyển gen để xác định một cách nhanh chóng và dễ dàng các mô đích đã thực sự mang gen chuyển hay chƣa cần có một hệ thống chọn lọc hiệu quả. Hệ thống này thƣờng chọn lọc thông qua gen chọn lọc (selectable marker gens) và gen chỉ thị (reporter gens). Các gen này thƣờng tổng hợp nên các phân tử protein giúp phân biệt các tế bào đã đƣợc biến nạp khỏi các tế bào không đƣợc biến nạp (gen chọn lọc), hoặc ghi nhận sự hoạt động của gen biến nạp (gen chỉ thị)
Gen chọn lọc thƣờng có tính trội, thông thƣờng có nguồn gốc từ vi khuẩn nhƣng hoạt động của chúng đƣợc kiểm soát bởi các promoter kiểu Eukaryote. Các gen chọn lọc phổ biến gồm: Các gen kháng kháng sinh nhƣ kanamycin (nptII), hygromycin (hpt),…; Các gen kháng chất diệt cỏ nhƣ glyphosate hoặc bialaphos (phosphinothricin, basta – gen bar có nguồn gốc vi khuẩn mã hóa cho enzyme làm bất hoạt basta là phosphinothricin acetyltranferaza (PAT)); Các gen khác nhƣ pmi – phosphate manose isomerase – chuyển hóa manose thành glucose. Nhờ vậy, cây có thể sống trên môi trƣờng không có glucose (manose là nhân tố chọn lọc) [2]. Một số cây trồng nhƣ ngô, bông, thuốc lá, arabidopsis, lanh, đậu tƣơng,… đã đƣợc chuyển gen kháng kháng sinh kanamycin (npt II) với nồng độ khác nhau từ 50 đến 500mg/l và đem lại hiệu quả trong việc ức chế sự tăng trƣởng của các tế bào không mang gen chuyển [61]. Thuốc kháng sinh khác đó là hygromycin cũng đã đƣợc sử dụng thành công nhƣ một nhân tố lựa chọn và trở thành tiêu chuẩn cho việc lựa chọn các mô chuyển gen đậu tƣơng, đặc biệt là các mô của phôi và các tế bào nách lá mầm [46]. Nghiên cứu của Olhoft và cs (2003) đã chứng minh rằng hygromycin làm giảm cả số lƣợng cây trồng không chuyển gen và thời gian nuôi cấy [32]. Một số nghiên cứu khác nhƣ sử dụng mức tối ƣu của glufosinate trong việc lựa chọn các chồi chuyển gen từ nách lá mầm [36], phát triển thành công một hệ thống để chọn các phôi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
bằng cách sử dụng E. coli Rao và cs (2009) đã tạo ra nhiều hệ thống chọn lọc mới cho cây trồng chuyển gen [30].
Gen chỉ thị là các gen có trách nhiệm thông báo là gen cần biến nạp đã gắn vào hệ gen thực vật và bắt đầu hoạt động hay chƣa. Các gen chỉ thị thƣờng dùng bao gồm: β-galactosidase, β-glucuronidase (GUS), Neomycin- phosphatase (NPT), protein phát huỳnh quang xanh lục GFP (green flourescence protein) và các dẫn xuất của nó [2],… Các gen chỉ thị mã hóa ra protein tƣơng ứng có thể dễ dàng bị phát hiện trong tế bào nhờ màu sắc thay đổi hoặc do nó phát huỳnh quang trong điều kiện thích hợp. Những chỉ thị có thể nhìn thấy này hiếm khi ảnh hƣởng đến tính trạng nghiên cứu nhƣng nó cung cấp một công cụ mạnh để xác định các tế bào biến đổi gen. Protein huỳnh quang màu xanh lá cây (GFP) đƣợc sử dụng nhƣ một dấu hiệu chỉ thị. GFP là một protein nhỏ đƣợc phân lập từ sứa. Nó sở hữu một bộ ba của amino acid hấp thụ ánh sáng màu xanh và phát huỳnh quang ánh sáng màu vàng xanh có thể phát hiện dễ dàng bằng cách sử dụng kính hiển vi huỳnh quang [62].