3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.3.Phương pháp nghiên cứu mô học
Áp dụng theo phương pháp mô bệnh học của D.V Lightner (1996)
Hình 3.4. Các bước thực hiện của phương pháp mô bệnh học
đọc tiêu bản trên kắnh hiển vi quang học ở các ựộ phóng ựại
x100, x400 và x1000 Cố ựịnh và bảo quản mẫu
Thu mẫu
đúc parafin Xử lý mẫu
Cắt lát mẫu
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ....... 18
Ớ Cố ựịnh và bảo quản mẫu
Dùng dụng cụ giải phẫu cắt lấy một miếng nhỏ mô (khoảng 0,5cm3) từ cơ ựể cố ựịnh trong dung dịch: 100ml fomalin 10%, 900ml nước cất, 0,4g Acidsodiumphosphate monohydrate (NaH2PO4.H2O; 6,5g Anhydrous disodiumphosphate (Na2HPO4), tỷ lệ về thể tắch giữa mẫu và dung dịch cố ựịnh là 1/10. Mẫu này ựược giữ trong dung dịch cố ựịnh từ 24 ựến 48 giờ tùy thuộc vào khối mẫu lớn hay nhỏ mà thời gian cố ựịnh khác nhau. Sau thời gian cố ựịnh, mẫu ựược bảo quản trong cồn etanol 70%. Thời gian ựể bảo quản trong cồn etanol không giới hạn. Tuy vậy, mẫu càng nhanh xử lý các bước tiếp theo càng tốt. Khi cố ựịnh và bảo quản cần ghi nhãn ựể tránh nhầm lẫn.
Ớ Xử lý mẫu
Mẫu ựược lấy ra khỏi cồn 70% và ựược làm mất nước bằng cách ngâm trong dung dịch cồn etanol với liều lượng tăng dần (70%, 95% và 100%) trong 4 giờ cho mỗi nồng ựộ cồn. Sau ựó tiếp tục ngâm mẫu trong dung dịch Methyl salicylate từ 12 ựến 24 giờ ựể làm mềm mẫu, rồi thấm parafin vào mẫu bằng cách ngâm các mẫu này trong parafin nóng chảy (600C) với thời gian ắt nhất là 6 giờ.
Ớ đúc mẫu trong Parafin
Lấy mẫu ựã ngâm trong parafin, phân bố vào các khuôn, ghi nhãn ựể không bị nhầm lẫn, sau ựó ựổ parafin nóng chảy vào khuôn, dùng panh ựể sắp xếp mẫu vào chắnh giữa khuôn, chuyển vào dàn lạnh ựể khối mẫu nhanh chóng ựông cứng thành khối parafin chứa mẫu ở trong.
Ớ Cắt và sấy mẫu
Mẫu sau khi ựúc parafin xong, ựược gọt thành khối hình thang cân hoặc hình chữ nhật. Sau ựó, gắn lên máy Microtom và tiến hành cắt mẫu với ựộ dày lát cắt 3 ựến 4 micromet. Lát cắt ựược ựưa vào nước ấm 40 - 500C trong khoảng 1 - 2 phút có thể lâu hơn ựể mẫu giãn hết cỡ không bị nhăn, trong nước ấm có bổ sung lòng trắng trứng gà. Tiếp theo, dùng lam sạch lấy lát cắt ra khỏi nước và ựặt lên máy sấy ở nhiệt ựộ 45 Ờ 600C trong 1 Ờ 4 giờ.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ....... 19
Ớ Phương pháp nhuộm Hematoxyline và Eosin (H&E)
Nhằm ựể phát hiện những biến ựổi trong tổ chức mô và tế bào khi nhiễm bệnh. Quy trình thực hiện nhuộm H&E như sau:
Làm mất parafin: Ớ Xilen I : 5 phút Ớ Xilen II: 5 phút Làm no nước mẫu: Ớ Etanol 100% 2 Ờ 3 phút Ớ Etanol 100% 2 Ờ 3 phút Ớ Etanol 95% 2 Ờ 3 phút Ớ Etanol 95% 2 Ờ 3 phút Ớ Etanol 75% 2 Ờ 3 phút Ớ Etanol 70% 2 Ờ 3 phút
Rửa nước: nhúng trong nước từ 1 Ờ 3 phút Nhuộm Hematoxyline Ờ Mayer từ 4 Ờ 6 phút Rửa qua nước chảy nhẹ từ 4 Ờ 6 phút
Nhuộm Eosin 2 phút Làm mất nước mẫu: Ớ Etanol 70% 2 Ờ 3 phút Ớ Etanol 75% 2 Ờ 3 phút Ớ Etanol 95% 2 Ờ 3 phút Ớ Etanol 95% 2 Ờ 3 phút Ớ Etanol 100% 2 Ờ 3 phút Ớ Etanol 100% 2 Ờ 3 phút Làm trong mẫu: Ớ Xilen I : 3 Ờ 5 phút Ớ Xilen II: 3 Ờ 5 phút
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ....... 20
đọc các tiêu bản nhuộm H &E dưới kắnh hiển vi quang học ở các ựộ phóng ựại: x100, x400 và x1000 ựể phát hiện các biến ựổi trong tế bào và trong mô cá ở 7, 14, 21 sau khi tiêm nhũ dầu và vắc xin có nhũ dầu.