4. ín ghĩa của đề tài
1.3.2. Phƣơng phỏp húa sinh
Phƣơng phỏp húa miễn dịch mang tớch đặc hiệu cao, dựa trờn nguyờn lý kết hợp khỏng nguyờn và khỏng thể đặc hiệu.
* Phương phỏp thử nghiệm miễn dịch phúng xạ (Radio Immuno Assay [RIA])
Trong RIA sự tạo thành phức khỏng nguyờn khỏng thể đƣợc xỏc định bằng khỏng nguyờn đỏnh dấu phúng xạ trong phản ứng cạnh tranh với khỏng nguyờn. Cơ
chế của miễn dịch phúng xạ đƣợc mụ phỏng: Cho một thểtớch dung dịch thử chứa một
lƣợng xỏc định khỏng nguyờn đỏnh dấu phúng xạ và một lƣợng khỏng nguyờn khụng đỏnh dấu (aflatoxin cần xỏc định) đƣợc cho tiếp xỳc với một lƣợng cố định khỏng thể. Phản ứng cạnh tranh giữa những khỏng nguyờn đỏnh dấu và khụng đỏnh dấu gắn vào khỏng thể sẽ xảy ra, sau một thời gian đạt đƣợc cõn bằng, vẫn cũn một vài khỏng nguyờn tự do. Tỉ lệ liờn kết tƣơng đối của khỏng nguyờn đỏnh dấu và khụng đỏnh dấu với khỏng thể tựy thuộc vào tỉ lệ nồng độ tƣơng đối của khỏng nguyờn đỏnh dấu và khụng đỏnh dấu; tỉ lệ này càng thấp, độ phúng xạ của phức khỏng nguyờn - khỏng thể càng thấp. Sau khi tỏch ly phức khỏng nguyờn - khỏng thể và những phần tử tự do, độ phúng xạ của phức đƣợc đo bằng mỏy đếm nhấp nhỏy lỏng từ đú ngƣời ta tớnh đƣợc lƣợng aflatoxin trong dung dịch mẫu đo, thƣờng dựa trờn đƣờng cong chuẩn.
Hiệnnay chỉ cú một vài thử nghiệm RIA trong nghiờn cứu độc tố vi nấm, việc
ỏp dụng RIA đũi hỏi cỏc phũng thớ nghiệm phải làm việc với chất phúng xạ tuy ở nồng độ thấp, và thời gian bảo quản cỏc đồng vị phúng xạ cú giới hạn, vấn đề thải bỏ chất phúng xạ, thờm vào đú cần phải cú mỏy đếm nhấp nhỏy đắt tiền.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
* Phương phỏp thử nghiệm miễn dịch men
Đõy là phƣơng phỏp dựa trờn sự liờn kết thuận nghịch giữa khỏng nguyờn và khỏng thể, sự tạo thành phức khỏng nguyờn - khỏng thể đƣợc định lƣợng giỏn tiếp bằng cỏch dựng khỏng nguyờn đỏnh dấu men trong phõn tử cạnh tranh gọi là kỹ thuật ELISA. Bao gồm ELISA trực tiếp và giỏn tiếp.
- Phương phỏp Elisa trực tiếp
Phƣơng phỏp ELISA trực tiếp dựa trờn nguyờn lý khỏng thể đặc hiệu đƣợc phủ trờn cỏc đĩa chuẩn độ. Dung dịch tỏch từ mẫu hay aflatoxin chuẩn đƣợc ủ cựng nhau. Sau đú đƣợc rửa bằng dung dịch thớch hợp. Lƣợng men đƣợc gắn vào đĩa đƣợc xỏc định bằng dung dịch đặc biệt. Phản ứng màu đƣợc đo bằng quang phổ hoặc so sỏnh bằng mắt thƣờng với cỏc đĩa tiờu chuẩn.
- Phương phỏp Elisa giỏn tiếp
Trong phƣơng phỏp này cỏc aflatoxin đƣợc gắn vào cỏc protein phủ cỏc đĩa chuẩn độ. Mẫu tỏch hay aflatoxin chuẩn đƣợc đƣa vào đĩa, tiếp. Lƣợng khỏng thể gắn vào đĩa đƣợc xỏc định do thờm IgG khỏng thể gắn với photphataza kiềm và phản ứng màu xảy ra với P - nitrophenyl photphat. Lƣợng độc tố đƣợc xỏc định bằng cỏch so sỏnh với lƣợng độc tố chuẩn.