4. ín ghĩa của đề tài
1.3.Cỏc phƣơng phỏp phõn tớch hàm lƣợng aflatoxin
1.3.1. Phƣơng phỏp lý húa
Cỏc phƣơng phỏp này dựng phỏt hiện và định lƣợng aflatoxin nhanh, chớnh xỏc và cú tớnh chuyờn biệt cao hơn so với phƣơng phỏp sinh học, hiện nay đƣợc dựng chủ yếu trong cỏc phũng thớ nghiệm.
* Phương phỏp sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography - TLC )
Phƣơng phỏp sắc kớ lớp mỏng đƣợc sử dụng rộng rói để xỏc định hàm lƣợng aflatoxin lần đầu tiờn vào những năm 1960.
Pha tĩnh là một lớp mỏng cú tớnh hấp phụ, thƣờng là silicagel, đƣợc phết lờn một bản mỏng (nhụm hoặc nhựa).
Pha động là dung mụi chứa chất cần khảo sỏt đƣợc cho chạy qua lớp mỏng chất hấp phụ nhờ lực mao quản.
Dịch chiết đƣợc chấm lờn bản mỏng thành cỏc đốm với thể tớch thƣờng là 2, 5, 10 àl; đốm chuẩn cũng đƣợc nhỏ lờn cựng bản mỏng. Sau đú, bản mỏng đƣợc cho vào dung mụi khai triển để cỏc đơn chất trong hỗn hợp cú thể tỏch rời nhau khi di chuyển bằng lực mao quản.
Dung mụi sử dụng cho dung dịch chạy bản mỏng là chloroform: methnol và choloroform: aceton. Việc thờm nƣớc vào hệ thống dung mụi sẽ làm tăng khả năng hũa tan aflatoxin.
Hệ dung mụi gồm nƣớc: aceton: chloroform (1.5:12:88 ) đƣợc đỏnh giỏ cú khả năng hũa tan aflatoxin tốt nhất [36]. Cỏc bản mỏng đó đƣợc chảy qua cỏc dung mụi chạy đƣợc đƣa vào bởi đốn tử ngoại (uv) 365mm. Cỏc vết mẫu phõn tớch tạo màu
huỳnh quang xanh da trời hay xanh lỏ cõy. Và cú độ dài Rf đƣợc so sỏnh với cỏc vết
của aflatoxin tiờu chuẩn. Phƣơng phỏp này cú thể đƣợc xỏc định lƣợng từ 3 - 4.10-4
Số húa bởi Trung tõm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
* Sắc kớ lớp mỏng hiệu suất cao (high performance thin layer chromatography - HPTLC)
Do những khiếm khuyết trong phƣơng phỏp sắc kớ lớp mỏng đơn thuần ở cỏc khõu nhƣ chiết tỏch mẫu phõn tớch, chạy mẫu trong dung mụi, phƣơng phỏp HPTLC cú tớnh thuyết phục cao hơn ở 3 khớa cạnh sau: đƣa mẫu lờn bản mỏng một cỏch tự động, cải thiện đƣợc sự đồng nhất cả lớp hấp phụ, chạy bản mỏng trong dung mụi cú kiểm soỏt.
Quỏ trỡnh đƣa mẫu vào bản mỏng đƣợc tự động húa, do đú cỏc vết đƣợc định đỳng vị trớ và đo lƣờng độ huỳnh quang của vết cũng bằng mỏy densitometess.
Thể tớch mẫu đƣợc dựng trong HPTLC cú thể bằng 1microlits so với 5 - 10 l mẫu trong phƣơng phỏp TLC, nhƣ vậy sẽ làm giảm đi rất nhiều diện tớch của vết (=1mm). Nồng độ chất chuẩn cú thể cần 5pg trong phõn tớch bằng HPTLC, do đú cú
thể xỏc định tới 30pg (0.03microgam) aflatoxin B1 ở lạc.
Sử dụng kĩ thuật HPTLC làm tăng tớnh thuyết phục của phƣơng phỏp TLC nhƣ một phƣơng phỏp định lƣợng aflatoxin cú hiệu quả nhất.
* Phương phỏp sắc ký lỏng hiệu năng cao (high performance liquid chromatography - HPLC)
HPLC là một phƣơng phỏp tỏch và phõn tớch cỏc hợp chất đƣợc sử dụng rộng rói và phổ biến nhất hiện nay vỡ nhiều lớ do: cú độ nhạy tƣơng đối cao, cú khả năng định lƣợng tốt, thớch hợp cho việc tỏch cỏc hợp chất khú bay hơi hoặc dễ bị phõn hủy nhiệt, cú phạm vi ứng dụng trải rộng trong nhiều lĩnh vực từ nghiờn cứu khoa học trong cỏc phũng thớ nghiệm đến cụng nghiệp và một số lĩnh vực khỏc.
Hợp chất cú thể phõn tớch bằng sắc ký lỏng nhƣ acid amin, protein, acid nucleic, hydrocacbon, carbohydrate, thuốc khỏng sinh, thuốc trừ sõu, cỏc hợp chất vụ cơ… Dựa vào sự khỏc nhau về cơ chế chiết tỏch sử dụng trong sắc ký lỏng hiệu năng cao mà ngƣời ta cú thể phõn chia nú ra làm cỏc loại: sắc ký hấp phụ, sắc ký phõn bố, sắc ký ion, sắc ký rõy phõn tử… trong đú sắc ký phõn bố đƣợc ứng dụng rộng rói và phổ biến. Tựy theo độ phõn cực pha tĩnh và dung mụi pha động, ngƣời ta phõn biệt: sắc ký lỏng pha thƣờng và sắc ký lỏng pha đảo.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Sắc ký lỏng pha thƣờng: Pha tĩnh cú độ phõn cực cao hơn độ phõn cực của dung mụi pha động, dựng để tỏch và phõn tớch cỏc hợp chất cú độ phõn cực cao với phõn tử lƣợng khụng lớn lắm.
- Sắc ký lỏng pha đảo: Ngƣợc với sắc ký pha thƣờng, pha tĩnh cú độ phõn cực thấp, pha động cú độ phõn cực cao hơn. Phƣơng phỏp này dựng để phõn tớch cỏc hợp chất từ khụng phõn cực đến phõn cực vừa. Dung mụi sử dụng là dung mụi phõn cực, trong đú nƣớc đúng vai trũ quan trọng mà lại rẻ tiền, do đú sắc ký lỏng pha đảo đƣợc sử dụng nhiều nhất.
1.3.2. Phƣơng phỏp húa sinh
Phƣơng phỏp húa miễn dịch mang tớch đặc hiệu cao, dựa trờn nguyờn lý kết hợp khỏng nguyờn và khỏng thể đặc hiệu.
* Phương phỏp thử nghiệm miễn dịch phúng xạ (Radio Immuno Assay [RIA])
Trong RIA sự tạo thành phức khỏng nguyờn khỏng thể đƣợc xỏc định bằng khỏng nguyờn đỏnh dấu phúng xạ trong phản ứng cạnh tranh với khỏng nguyờn. Cơ
chế của miễn dịch phúng xạ đƣợc mụ phỏng: Cho một thểtớch dung dịch thử chứa một
lƣợng xỏc định khỏng nguyờn đỏnh dấu phúng xạ và một lƣợng khỏng nguyờn khụng đỏnh dấu (aflatoxin cần xỏc định) đƣợc cho tiếp xỳc với một lƣợng cố định khỏng thể. Phản ứng cạnh tranh giữa những khỏng nguyờn đỏnh dấu và khụng đỏnh dấu gắn vào khỏng thể sẽ xảy ra, sau một thời gian đạt đƣợc cõn bằng, vẫn cũn một vài khỏng nguyờn tự do. Tỉ lệ liờn kết tƣơng đối của khỏng nguyờn đỏnh dấu và khụng đỏnh dấu với khỏng thể tựy thuộc vào tỉ lệ nồng độ tƣơng đối của khỏng nguyờn đỏnh dấu và khụng đỏnh dấu; tỉ lệ này càng thấp, độ phúng xạ của phức khỏng nguyờn - khỏng thể càng thấp. Sau khi tỏch ly phức khỏng nguyờn - khỏng thể và những phần tử tự do, độ phúng xạ của phức đƣợc đo bằng mỏy đếm nhấp nhỏy lỏng từ đú ngƣời ta tớnh đƣợc lƣợng aflatoxin trong dung dịch mẫu đo, thƣờng dựa trờn đƣờng cong chuẩn.
Hiệnnay chỉ cú một vài thử nghiệm RIA trong nghiờn cứu độc tố vi nấm, việc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ỏp dụng RIA đũi hỏi cỏc phũng thớ nghiệm phải làm việc với chất phúng xạ tuy ở nồng độ thấp, và thời gian bảo quản cỏc đồng vị phúng xạ cú giới hạn, vấn đề thải bỏ chất phúng xạ, thờm vào đú cần phải cú mỏy đếm nhấp nhỏy đắt tiền.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
* Phương phỏp thử nghiệm miễn dịch men
Đõy là phƣơng phỏp dựa trờn sự liờn kết thuận nghịch giữa khỏng nguyờn và khỏng thể, sự tạo thành phức khỏng nguyờn - khỏng thể đƣợc định lƣợng giỏn tiếp bằng cỏch dựng khỏng nguyờn đỏnh dấu men trong phõn tử cạnh tranh gọi là kỹ thuật ELISA. Bao gồm ELISA trực tiếp và giỏn tiếp.
- Phương phỏp Elisa trực tiếp
Phƣơng phỏp ELISA trực tiếp dựa trờn nguyờn lý khỏng thể đặc hiệu đƣợc phủ trờn cỏc đĩa chuẩn độ. Dung dịch tỏch từ mẫu hay aflatoxin chuẩn đƣợc ủ cựng nhau. Sau đú đƣợc rửa bằng dung dịch thớch hợp. Lƣợng men đƣợc gắn vào đĩa đƣợc xỏc định bằng dung dịch đặc biệt. Phản ứng màu đƣợc đo bằng quang phổ hoặc so sỏnh bằng mắt thƣờng với cỏc đĩa tiờu chuẩn.
- Phương phỏp Elisa giỏn tiếp
Trong phƣơng phỏp này cỏc aflatoxin đƣợc gắn vào cỏc protein phủ cỏc đĩa chuẩn độ. Mẫu tỏch hay aflatoxin chuẩn đƣợc đƣa vào đĩa, tiếp. Lƣợng khỏng thể gắn vào đĩa đƣợc xỏc định do thờm IgG khỏng thể gắn với photphataza kiềm và phản ứng màu xảy ra với P - nitrophenyl photphat. Lƣợng độc tố đƣợc xỏc định bằng cỏch so sỏnh với lƣợng độc tố chuẩn.
1.4. Xử lý aflatoxin trong nụng sản và phụ phẩm chế biến hiện nay
Cỏc nụng sản và phụ phẩm chế biến bị nhiễm độc tố aflatoxin cú thể gõy nguy hiểm đến sức khỏe con ngƣời và động vật. Vỡ vậy cỏc nhà khoa học đó tỡm kiếm cỏc phƣơng phỏp để loại trừ hay phỏ hủy cỏc aflatoxin trong cỏc sản phẩm bị nhiễm. Phƣơng phỏp giải quyết tốt nhất là kiềm chế aflatoxin và phũng ngừa. Tuy nhiờn sự nhiễm aflatoxin đụi khi là khụng thể trỏnh đƣợc, và nếu phũng ngừa thất bại thỡ phải xem tới cỏc biện phỏp xử lý. Cỏc kỹ thuật dựng để khử aflatoxin trong cỏc mặt hàng khỏc nhau bao gồm phũng trừ bằng phƣơng phỏp vật lý, húa học và sinh học.
1.4.1. Phƣơng phỏp vật lý
Số húa bởi Trung tõm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Phƣơng phỏp này đó đƣợc nhiều tỏc giả nghiờn cứu nhƣ Lee (1969); Waltking (1977); Elkady (1981); Frank (1974), dựng khụng khớ núng thổi qua nguyờn liệu chứa aflatoxin để giảm thiểu hàm lƣợng aflatoxin. Phƣơng phỏp này đem lại hiệu quả đỏng
kể. Vớ dụ ở trờn lạc nếu sức núng 130oC trong vũng 5 phỳt cú thể làm giảm aflatoxin
từ 2000 ppb xuống cũn 1000 ppb. Nếu thổi với nhiệt độ là 100 - 145oC lƣợng
Số húa bởi Trung tõm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
* Xử lý aflatoxin bằng hấp ướt ở ỏp suất cao
Aflatoxin rất bền vững với nhiệt. Độ ẩm là yếu tố giỳp cho nhiệt độ làm giảm aflatoxin. Phƣơng phỏp hấp ƣớt ở nhiệt độ cao với ỏp lực hơi nƣớc đem lại hiệu quả khả quan hơn. Nhiều thớ nghiệm đƣợc tiến hành bằng phƣơng phỏp đun nấu thụng
thƣờng (nhiệt độ = 1000C), song kết quả cho thấy khụng làm giảm đƣợc lƣợng
aflatoxin cú trong mẫu phõn tớch. Khi đun sụi nguyờn liệu nấu bia ở 1000C vẫn tỡm
thấy 90% lƣơng aflatoxin so với lƣợng độc tố ban đầu. Nguyờn liệu bị nhiễm aflatoxin
cho vào nồi hấp (điiều chỉnh nhiệt độ và ỏp suất), hấp ƣớt ở nhiệt độ 1200C, thời gian
từ 3 - 5 giờ. Phƣơng phỏp này đƣợc Coomes (1996), Elkady (1981) và một số tỏc giả khỏc thực hiện.
* Phương phỏp chiếu xạ
Phƣơng phỏp vật lý đƣợc sử dụng nhiều ở Liờn Xụ từ nhiều năm về trƣớc để
bảo quản nụng sản. Phƣơng phỏp chiếu xạ sử dụng cỏc tia gama (γ) tiến hành ở liều
1; 5; 10 và 15 Mrad (Mega rad), tia cực tớm (UV light) ở bƣớc súng 365nm để làm giảm hàm lƣợng aflatoxin trong nguyờn liệu tuy nhiờn phƣơng phỏp này khụng mang lại ý nghĩa kinh tế [8].
Ngoài ra, theo cỏc nhà khoa học Ấn Độ cũng khẳng định, dƣới tỏc động của
ỏnh sỏng mặt trời aflatoxin B1 cũng giảm đƣợc từ 83% xuống 50%.
1.4.2. Phƣơng phỏp húa học (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhiều hoỏ chất cú thể phỏ huỷ aflatoxin tinh khiết hay aflatoxin trong cỏc nguyờn liệu nhiễm tự nhiờn; cụ thể nhƣ chlorin, ozon, axit hydrochloric, peroxit benzoic, amoniac, natri hydrochlorit và etanolamin... Đỏng tiếc, nhiều hoỏ chất khảo sỏt đó khụng thoả món tất cả những tiờu chuẩn trờn. Mặc dự chỳng phỏ huỷ cỏc aflatoxin nhƣng lại làm giảm đỏng kể giỏ trị dinh dƣỡng của nguyờn liệu xử lý và tạo nờn cỏc sản phẩm độc hay cỏc sản phẩm cú những tỏc dụng phụ khụng mong muốn. Theo Bựi Xuõn Đồng (1999) [6] cú tới vài chục chất húa học cú khả năng phỏ hủy độc tố aflatoxin, song hai chất cú triển vọng nhất vỡ đem lại hiệu quả cao và rẻ tiền là xỳt, amoniac. Nhiều cụng trỡnh nghiờn cứu cho thấy rằng dựng xỳt (NaOH) với lƣợng 2%
Số húa bởi Trung tõm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
so với lƣợng khụ dầu và khụ dầu phải thật ẩm (chứa 30% nƣớc) thỡ độc tố đƣợc làm sạch. Đối với amoniac cú khả năng phỏ hủy tới 99% aflatoxin ở lạc và khụ dầu lạc mà lại khụng làm ảnh hƣởng tới chất lƣợng của sản phẩm. Nghiờn cứu của EI Batan (1986) [40] cũng chỉ ra rằng amoniac cú tỏc dụng khử độc tố aflatoxin trong ngụ, kết quả ban đầu lƣợng aflatoxin giảm tử 100 ppb xuống cũn 10 ppb.
Đậu Ngọc Hào (2003) [8] cho biết, cú thể sử dụng hỗn hợp NaOCl và H2O2 để
phõn hủy aflatoxin. Thớ nghiệm đƣợc thực hiện trờn ngụ khi sử lý bằng dung dịch 3%
H2O2 trong 1 giờ ở 65oC lƣợng aflatoxin B1 giảm từ 379 ppb xuống cũn 20 ppb. Nhiều
tỏc giả cũng cho rằng cú thể loại bỏ aflatoxin B1 hoàn toàn bằng hỗn hợp 2% NaOCl và
12% H2O2 ở điều kiện bỡnh thƣờng.
1.4.3. Phƣơng phỏp sinh học
Việc sử dụng cỏc chủng khụng cú hại cho con ngƣời và thực phẩm mà lại cú khả năng giảm sự tạo độc tố hoặc ức chế hoàn toàn việc tạo độc tố là biện phỏp lý tƣởng.
Nhiều nghiờn cứu sử dụng cỏc chủng đối khỏng với cỏc chi nấm mốc Aspergillus,
Fusarium, Rhizoctonia, Alternaria, Claviceps... đó và đang tiếp tục trong nhiều năm. Biện phỏp phũng trừ nấm mốc bằng cỏc chủng đối khỏng căn cứ vào những đặc điểm di truyền học (trao đổi chất, tự phõn đụi nhõn, đột biến, tiết enzym cú tỏc dụng thuỷ phõn…) tớnh cạnh tranh sinh thỏi (nguồn dinh dƣỡng, điều kiện nhiệt độ và độ ẩm…).
Một phƣơng hƣớng mới trong việc chống nhiễm aflatoxin dựa vào tớnh cạnh tranh là sử dụng loài vi sinh vật sinh sống trong vựng rễ cõy lạc hoặc vựng đất xung
quanh củ lạc để cạnh tranh và ức chế sự phỏt triển của Aspergillus flavus .
Nguyễn Thựy Chõu (2009) [4] đó nghiờn cứu và sản xuất một số chế phẩm vi sinh để phũng chống nấm sinh độc tố và độc tố nấm mốc aflatoxin trờn ngụ, lạc ở giai đoạn ngoài đồng và hạn chế sự nhiễm trong thời gian bảo quản. Từ 2 chủng
Aspergillus flavus DA1 và DA2 khụng sinh độc tố cú khả năng ức chế sự tạo thành
aflatoxin. Hiệu quả giảm độc tố aflatoxin của chủng Aspergillus flavus DA1 và DA2 là
Số húa bởi Trung tõm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chế phẩm này đƣợc bún vào đất trồng ngụ qua hai vụ liờn tiếp. Kết quả cho thấy, cỏc nấm Aspergillus flavus nhiễm trong đất giảm 85% so với lụ khụng bún chế phẩm, năng suất ngụ thu hoạch tăng 18,8%. Với cựng điều kiện bảo quản, ngụ khụng bún chế phẩm đó xuất hiện khỏ nhiều mọt, trong đú ngụ bún chế phẩm bảo quản vẫn chƣa thấy bị mọt. Ngụ bún chế phẩm bảo quản sau 2,5 thỏng quan sỏt bằng mắt thƣờng vẫn chƣa thấy mốc, hàm lƣợng aflatoxin trung bỡnh trong cỏc mẫu ngụ bảo quản là 5ppb (dƣới mức tiờu chuẩn cho phộp), trong khi đú cỏc mẫu ngụ khụng bún chế phẩm cú hàm lƣợng aflatoxin trung bỡnh là 32 ppb. Chế phẩm này đƣợc bún vào đất trồng lạc qua
một vụ. Kết quả cho thấy cỏc nấm Aspergillus flavus nhiễm trong đất giảm 80% so với
lụ khụng bún chế phẩm, năng suất lạc thu hoạch tăng 20%. Với cựng điều kiện bảo quản, lạc bún chế phẩm bảo quản sau 5 thỏng quan sỏt bằng mắt thƣờng vẫn chƣa thấy mốc, hàm lƣợng aflatoxin trung bỡnh trong cỏc mẫu lạc bảo quản là 11ppb, trong khi đú cỏc mẫu lạc khụng bún chế phẩm cú hàm lƣợng aflatoxin trung bỡnh là 55 ppb.
Hiện nay đó cú nhiều chế phẩm sinh học đƣợc nghiờn cứu và sản xuất thành cụng nhƣ:
- Tập đoàn China medicine của Trung Quốc đó thực hiện một dự ỏn nghiờn cứu và sản xuất thành cụng một sản phẩm sinh học gọi là rADTZ (recombinant Aflatoxin Detoxifizym Enzyme). Hợp chất này là dẫn xuất của một men ngoại tế bào - men khử độc tố aflatoxin (Aflatoxin detoxifizym - ADTZ), men này cú khả năng làm phỏ vỡ cấu trỳc aflatoxin. Do đú, rADTZ cú triển vọng dựng để làm một chất khử độc tố aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn gia sỳc. Hơn nữa, rADTZ cũng cho một khả năng hứa hẹn trong việc điều trị ung thƣ gan và ung thƣ dạ dày [25].
- Biodone là sản phẩm của ISIA pacific Pte LTD. Cú thể trộn trực tiếp vào thức ăn, hoặc cho gia sỳc uống trực tiếp chế phẩm này.
- Alvefix plus là sản phẩm của hóng Avetra GmbH (Hà Lan). Đối với gà dũ sử dụng hàm lƣợng 2kg/tấn thức ăn trong 4 tuần đầu. Đối với lợn con là 2kg/tấn thức ăn và sau đú là 1kg/tấn thức ăn ở giai đoạn vỗ bộo [11].
Số húa bởi Trung tõm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
1.5. Tỡnh hỡnh nghiờn cứu aflatoxin trờn thế giới và trong nƣớc 1.5.1. Tỡnh hỡnh nghiờn cứu trờn thế giới 1.5.1. Tỡnh hỡnh nghiờn cứu trờn thế giới
Hầu nhƣ tất cả cỏc sản phẩm thực vật đều cú thể là cơ chất cho sự phỏt triển của nấm mốc và sự tạo mycotoxin tiếp theo, do đú nú cú khả năng nhiễm trực tiếp vào thực phẩm của con ngƣời. Khi gia sỳc ăn cỏc thức ăn cú mycotoxin chỳng khụng chỉ