4. ín ghĩa của đề tài
1.5. Tỡnh hỡnh nghiờn cứu aflatoxin trờn thế giới và trong nƣớc
1.5.1. Tỡnh hỡnh nghiờn cứu trờn thế giới
Hầu nhƣ tất cả cỏc sản phẩm thực vật đều cú thể là cơ chất cho sự phỏt triển của nấm mốc và sự tạo mycotoxin tiếp theo, do đú nú cú khả năng nhiễm trực tiếp vào thực phẩm của con ngƣời. Khi gia sỳc ăn cỏc thức ăn cú mycotoxin chỳng khụng chỉ chịu tỏc dụng độc trực tiếp mà cũng là nguồn mang mycotoxin vào sữa, thịt và nhƣ vậy tạo sự nhiễm mycotoxin vào con ngƣời. Những độc tớnh của mycotoxin đối với động vật thực nghiệm đó đƣợc chứng minh là rất lớn. Cỏc mycotoxin đó thu hỳt đƣợc sự quan tõm của cỏc nhà khoa học ở nhiều lĩnh vực khỏc nhau. Mycotoxin đó đƣợc phỏt hiện ra rất sớm ngay từ đầu thập niờn 60. Từ khi phỏt hiện ra aflatoxin thỡ khoảng 15 năm sau, ngƣời ta đó phỏt hiện thờm 7 loại mycotoxin khỏc cú ảnh hƣởng xấu đến sức khỏe và năng suất của gia sỳc gia cầm. Ngày nay con số này mỗi ngày một tăng thờm lờn đến trờn 300 loại độc tố mycotoxin. Sự nhiễm độc tố nấm trong nụng sản đó trở thành vấn đề toàn cầu.
Theo tỏc giả Trƣơng Quốc Phỳ (2005) [14] từ những năm 1960 khi ở Anh nghề nuụi gia cầm bị tổn thất nặng nề, lỳc đầu hơn 10000 gà tõy chết vỡ một bệnh mới gọi là “bệnh gà tõy X” (Turkey X disease). Sau đú, cỏc loài gia cầm khỏc nhƣ vịt, gà lụi cũng bị nhiễm bệnh và tử vong rất nhiều.
Đến năm 1961 ngƣời ta đó tỡm ra bản chất hoỏ học của độc chất này là
aflatoxin do vi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus sinh ra [29]. Cũng
trong năm 1961 ở Anh ngƣời ta tiến hành thực nhiệm trờn chuột cống, cho ăn thức ăn nhiễm nấm mốc trong đú 20% là bột lạc thối, sau 6 thỏng thấy xuất hiện ung thƣ gan.
Ở Thỏi Lan năm 1967 nhúm nghiờn cứu của Shank cho thấy cỏc mẫu lƣơng thực, thực phẩm bị mốc thỡ 50 - 60% số mốc đú cú độc tố aflatoxin. Đồng thời nhúm tỏc giả tiến hành trờn thức ăn gia đỡnh (lấy mẫu lƣơng thực, thực phẩm tại cỏc gia đỡnh) thỡ cũng thấy cú 30 - 50% số mẫu cú độc tố aflatoxin [14]. Trờn động vật thủy sản, những nghiờn cứu đầu tiờn về độc tố aflatoxin trờn cỏ hồi đƣợc thực hiện bởi Ashley (1964) và Halver (1965) (Roberts, 2002) [38].
Số húa bởi Trung tõm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Theo Diab và cs (2000) [31] ở Ai Cập cú 32% ngũ cốc và 6% bột cỏ đem kiểm nghiệm bị nhiễm aflatoxin từ 1 - 50 ppb; 8% ngũ cốc và 16% bột cỏ bị nhiễm từ 201 - 2000 ppb.
Ở Pakistan theo nghiờn cứu của Bhatti (2001) [27] trong 3320 mẫu nguyờn liệu
cú nguồn gốc động, thực vật đƣợc kiểm nghiệm đều cú chứa aflatoxin B1 với hàm lƣợng
thấp nhất là 13 và cao nhất là 78 ppb. Hầu hết cỏc mẫu cỏm gạo, cỏm lỳa mỡ, bột bắp, bột
cỏ, bột hƣớng dƣơng, bột đậu nành và bột hạt bụng đều cú hàm lƣợng aflatoxin B1 cao
hơn mức khuyến cỏo của tổ chức FDA, Hoa Kỳ (20ppb).
1.5.2. Tỡnh hỡnh nghiờn cứu trong nƣớc
Ở nƣớc ta cũng đó cú một số tỏc giả nghiờn cứu về mức độ nhiễm aflatoxin trờn lƣơng thực, thực phẩm và đạt đƣợc những kết quả đỏng khớch lệ. Từ những năm 1970, Nguyễn Phựng Tiến và cs đó nghiờn cứu mức độ nhiễm mốc trờn ngụ, kết quả là 38 mẫu bảo quản trong kho lƣơng thực của thành phố Thanh Húa đó nhiễm nấm mốc
thuộc cỏc chi sau: Aspergillus, Cladosporium, Penillium, Sporotrichuro, Saccharomyces,
Trichoderma, Geotrichum [13].
Năm 1996 Nguyễn Thựy Chõu [3] cụng bố cụng trỡnh nghiờn cứu về sự nhiễm nấm mốc và aflatoxin trờn một số giống ngụ, lạc trồng ở một số tỉnh và khả năng phũng
trừ bằng chủng Aspergillus flavus khụng sinh độc tố, với kết quả: Tại thị trƣờng Nghệ
An, Hà Nội, Đồng Nai, tỷ lệ nhiễm nấm mốc trờn ngụ từ 10 - 100%. Mẫu lạc tỷ lệ nhiễm từ 2 - 100%, 25% mẫu ngụ phõn tớch đó nhiễm aflatoxin với hàm lƣợng 25 ppb đến 36
ppb. Cỏc chủng Aspergillus flavus khụng sinh độc tố làm giảm sản lƣợng aflatoxin một
cỏch đỏng kể từ 331 ppb xuống cũn 5 ppb. Ở ngụ đó phõn lập đƣợc hai chủng
Aspergillus flavus GL và NN1 cú tỏc dụng ức chế sự phỏt triển của cỏc nấm sản sinh aflatoxin.
Nguyễn Đức Lƣợng (2003) [11] cho biết theo kết quả của Viện Vệ sinh dịch tễ đó nghiờn cứu trờn 29381 mẫu lƣơng thực thực phẩm cho thấy cú 30 loại nấm mốc
khỏc nhau, trong đú Aspergillus chiếm tỉ lệ cao nhất (5,2 - 80,39%) bao gồm 12 chủng
Số húa bởi Trung tõm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Theo kết quả nghiờn cứu của Nguyễn Thị Cẩm Vi (2010) [23] cho biết: Những nghiờn cứu bƣớc đầu của Bộ mụn Dinh dƣỡng và An toàn thực phẩm (Trƣờng Đại Học Y Hà Nội) cho thấy trong 30 mẫu tƣơng ăn xấp xỉ 30% số mẫu tƣơng cú độc tố aflatoxin.
Theo tỏc giả Lờ Đức Ngoan và cs (2005) [12] nghiờn cứu và hàm lƣợng aflatoxin trong một số nguyờn liệu sử dụng làm thức ăn ở Việt Nam nhƣ sau:
Số húa bởi Trung tõm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 1.7. Hàm lƣợng aflatoxin trong một số nguyờn liệu làm thức ăn [12].
Đơn vị: ppb Tờn thực phẩm Hàm lƣợng aflatoxin trung bỡnh Hàm lƣợng aflatoxin tối đa Bắp hạt 205 600 Gạo và tấm gạo 22 25 Đậu nành hạt 50 50 Cỏm gạo 29 55 Khụ dầu mố 8 10 Khụ dầu dừa 17 50 Khụ dầu đậu nành 12 50 Khụ dầu đậu phộng 1200 5000 Bột khoai mỡ lỏt 40 40 Thức ăn hỗn hợp 105 500
Số húa bởi Trung tõm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CỨU 2.1. Vật liệu nghiờn cứu
- Một số sản phẩm là nụng sản thực phẩm dựng cho ngƣời và vật nuụi nhƣ; ngụ, lạc, khụ dầu đậu tƣơng, cỏm gạo… thu đƣợc tại một số tỉnh miền nỳi phớa Bắc.
Hỡnh 2.1. Mẫu cỏm gạo Hỡnh 2.2. Mẫu khụ đỗ tƣơng
Hỡnh 2.3. Mẫu ngụ Hỡnh 2.4. Mẫu lạc 2.2. Địa điểm, thời gian nghiờn cứu
Số húa bởi Trung tõm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Thời gian: từ 06/2013 đến 10/2014.
2.3. Húa chất và thiết bị nghiờn cứu 2.3.1. Húa chất 2.3.1. Húa chất
Tất cả cỏc húa chất đều cú độ tinh sạch cần thiết, đảm bảo cỏc tiờu chuẩn dành cho húa chất dựng trong phũng thớ nghiệm (PTN) và đƣợc sử dụng đỳng theo những hƣớng dẫn và khuyến cỏo của nhà sản xuất. Một số húa chất chớnh sử dụng trong nghiờn cứu: Chuẩn aflatoxin mix (sigma), acetonitril (merck), methanol (merck), benzen ( merck), chlorform (merck), diclomethan (merck), hexan (merck), acetone (merck), amoniac, nƣớc cất 2 lần khử ion (PTN)… và một số chất khỏc.
2.3.2. Thiết bị
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao với detecter UV và RF, cột sắc ký pha đảo C18, 150mm ì 4.6mm ì 5μm, cõn phõn tớch độ chớnh xỏc ±0,1mg, cõn kỹ thuật độ chớnh xỏc ± 0,01mg, tủ sấy, mỏy đồng nhất mẫu, mỏy lắc ngang, mỏy rung siờu õm, mỏy cụ quay chõn khụng, cú nồi cỏch thủy đặt dƣới và cỏc trang thiết bị thực nghiệm cơ bản khỏc thuộc Phũng Phõn tớch húa học, Viện Khoa học sự sống - Đại học Thỏi Nguyờn.
2.4. Phƣơng phỏp nghiờn cứu 2.4.1. Phƣơng phỏp lấy mẫu 2.4.1. Phƣơng phỏp lấy mẫu
Mẫu đƣợc lấy theo TCVN 4325:2007 (ISO 6497: 2002) [17]. Lấy mẫu ban đầu ngẫu nhiờn từ nơi chứa, phải đảm bảo rằng tất cả cỏc lớp đều cú mẫu đại diện nhƣ nhau. Sau đú, gộp và trộn đều tất cả cỏc mẫu ban đầu lại sẽ đƣợc mẫu chung cho sản phẩm. Mẫu chung đƣợc cho vào tỳi nilon để khụng làm ảnh hƣởng tới chất lƣợng mẫu. Từ mẫu chung chia làm 3 phần. Một phần đƣợc xử lý mẫu theo TCVN 6952: 2001 (ISO 6498: 2002) [18] để phõn tớch hàm lƣợng aflatoxin và hàm lƣợng vật chất khụ ngay. Hai phần cũn lại tiến hành xử lý bằng hai phƣơng phỏp khỏc nhau.
2.4.2. Phƣơng phỏp xử lý mẫu
Số húa bởi Trung tõm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Nghiền mẫu: Sử dụng mỏy nghiền mẫu chuyờn dụng, thao tỏc tiến hành càng nhanh càng tốt, để giảm thiểu sự tiếp xỳc mẫu với khụng khớ, dẫn đến làm giảm hoặc tăng độ ẩm của mẫu khi phõn tớch.
- Bảo quản mẫu: Mẫu sau khi đƣợc nghiền nhỏ, đựng trong tỳi nilon cú ghi kớ hiệu mẫu và cỏc thụng tin cần thiết.
2.4.3. Phƣơng phỏp xử lý hàm lƣợng aflatoxin trong một số loại nụng sản thực phẩm
Hiện nay cú rất nhiều những phƣơng phỏp để xử lý hàm lƣợng aflatoxin trong nụng sản và phụ phẩm chế biến. Tuy nhiờn do điều kiện trang thiết bị, mỏy múc của Viện Khoa học sự sống - Đại học Thỏi Nguyờn nờn tụi tiến hành xử lý aflatoxin bằng 2 phƣơng
phỏp: phƣơng phỏp sấy khụ và phƣơng phỏp sử dụng khớ NH3 1.5%.
* Phương phỏp sử dụng khớ NH3
- Nguyờn lý: Sử dụng NH3 cú khả năng làm vụ hoạt aflatoxin. Chất này cú hoạt tớnh
mạnh, cú thể phỏ vỡ vũng lactone trong cấu trỳc phõn tử aflatoxin [28].
- Cỏch tiến hành: Cho nguyờn liệu nhiễm aflatoxin vào trong cỏc tỳi polietylen kớn cú
chứa khớ NH3 nồng độ 1,5% trong thời gian 14 ngày. Mỗi mẫu đƣợc cho vào một tỳi riờng
và để trong phũng đảm bảo thụng thoỏng, khụng ẩm ƣớt. Mẫu sau khi xử lý xong đƣợc phõn tớch ngay.
* Phương phỏp sấy khụ
- Nguyờn lý: Aflatoxin là một độc tố bền vững với nhiệt độ. Nhƣng bằng phƣơng phỏp
sấy khụ cú thể làm giảm đƣợc hàm lƣợng aflatoxin trong nụng sản là nhờ vào yếu tố độ ẩm. Nƣớc trong nụng sản thủy phõn làm mất nhúm carboxyl trong phõn tử aflatoxin. Khi nhúm carboxyl mất dẫn đến nhõn lactam bị phỏ vỡ và phõn tử aflatoxin bị phỏ hủy.
- Cỏch tiến hành: Dựng tủ sấy điều chỉnh đƣợc nhiệt độ (± 0.5oC) để sấy cỏc nguyờn
liệu nhiễm aflatoxin ở nhiệt độ 160oC trong thời gian 30 phỳt, tớnh từ khi tủ sấy đạt
Số húa bởi Trung tõm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2.4.4. Phƣơng phỏp phõn tớch hàm lƣợng aflatoxin
Phõn tớch hàm lƣợng aflatoxin trong một số nụng sản và phụ phẩm chế biến đƣợc tiến hành theo TCVN 7596 - 2007 (ISO 16050 - 2003) [19] trờn mỏy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.
* Nguyờn lý của phương phỏp
Dựa vào sự phõn bố trờn pha động và pha tĩnh khỏc nhau, chỳng cú sự tƣơng tỏc khỏc nhau do đú mà tớnh chất khỏc nhau sẽ bị tỏch trong cột tỏch. Sau đú aflatoxin đƣợc phỏt hiện nhờ đầu dũ huỳnh quang, giới hạn phỏt hiện của phƣơng phỏp là 0,3ng/g cho mỗi aflatoxin.
* Húa chất và thiết bị
- Húa chất: Cỏc loại húa chất dựng cho phƣơng phỏp phõn tớch trờn mỏy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC: chlorform, benzen, methanol, diclomethal, acetone, hexan…
+ Dung dịch chuẩn: đƣợc cung cấp dƣới dạng dung dịch chuẩn mix chứa aflatoxin B1,
G1: 0,3 ppb và aflatoxin B2, G2: 1 ppb trong ống xilanh kớn màu nõu, thể tớch 1ml.
Chuyển toàn bộ vào vial màu nõu. Bảo quản trong tủ lạnh ngăn đỏ dƣới 0oC và ỏnh
sỏng trực tiếp.
+ Thuốc thử: Dung mụi hỗn hợp của acetonitril: methanol với tỷ lệ 1:1 trộn thật đều rồi lọc qua bộ lọc.
+ Hỗn hợp dung dịch rửa tạp: dựng hexan và diclomethan với tỷ lệ 1:1, dựng khoảng 3ml cho mỗi lần rửa.
+ Hỗn hợp dung dịch rửa giải: dựng acetonitril và chlorform với tỷ lệ 90:10, dựng khoảng 6 - 10ml cho mỗi lần rửa.
- Thiết bị bao gồm: Mỏy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC với detecter UV và RF, cột sắc ký pha đảo C18, mỏy rung siờu õm, mỏy lắc, bơm chõn khụng và bộ hỳt manifod, cột chiết pha rắn SPE silicagel.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ * Tớnh toỏn kết quả:
Căn cứ vào sự tƣơng quan giữa diện tớch pic và nồng độ, căn cứ vào diện tớch pic mẫu tớnh kết quả theo cụng thức sau:
X (μg/g) = VìKìCm/m
Trong đú:
V: Thể tớch dịch chiết cuối cựng chạy bằng mỏy HPLC (ml).
Cm: Nồng độ aflatoxin trong dịch chiết mẫu tớnh theo chuẩn (ng/ml).
m: Khối lƣợng của mẫu phõn tớch (g).
X: Hàm lƣợng aflatoxin trong mẫu phõn tớch (ng/g). K: Hệ số pha loóng (tỷ lệ dịch lấy so với lƣợng chiết). - Cỏch tớnh kết quả:
Kết quả đƣợc mỏy phõn tớch tự động tớnh toỏn bằng phần mềm đƣợc lập trỡnh sẵn trong mỏy.
- Điều kiện để chấp nhận kết quả:
+ Tất cả cỏc yờu cầu về độ tƣơng thớch phải đỏp ứng đầy đủ.
+ Peak của aflatoxin phải đƣợc tỏch ra khỏi dung mụi và phải đƣợc rửa giải gần sỏt thời gian ra của paek chuẩn.
+ Tớnh toỏn hệ số tƣơng quan R phải ≥ 0,9990. - Kiểm soỏt chất lƣợng:
Phõn tớch lặp lại 2 lần song song khụng đƣợc lệch quỏ 10% so với giỏ trị trung bỡnh, nếu khụng phõn tớch lại để lấy kết quả lặp cao.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Lắc 30 phỳt, 140v/p Lắc, để yờn đến phõn lớp
Lọc lấy dịch lọc cho vào cụ quay Thu lớp dƣới cho vào cụ
quay
Nạp mẫu qua cột (2ml/phỳt)
Hoạt húa: 3ml Hexan,3 ml Diclomethal Rửa tạp: 3ml hexan, 3ml Diclomethal Rửa giải =10ml hỗn hợp Cloroform:aceton (90:10) Cụ cạn, hũa cặn bằng 1ml Methanol HPLC +100ml Cloroform Lắc 30 phỳt, 140v/p Lọc, lấy 40ml dịch lọc +40ml NaCl 1% +25ml Hexan Cụ cạn, hũa cặn = 10ml Diclomethal Lớp trờn 25ml, 25ml Clorofofm Làm sạch trờn cột
Mẫu rắn (Xay nhỏ, trộn đều) Cõn 10-20gam
Nhiều bộo Ít bộo
+ 100ml Methanol: H2O(85:15)
Quy trỡnh phõn tớch mẫu mmmm mõ
Số húa bởi Trung tõm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hỡnh 2.4. Sắc đồ aflatoxin của mẫu chuẩn
Hỡnh 2.5. Sắc đồ aflatoxin chuẩn ở cỏc nồng độ 5; 10; 20 ppb
Tiến hành xõy dựng đƣờng cong ở những nồng độ khỏc nhau: 5; 10; 20 ppb để lập đƣờng chuẩn. Qua đú thấy rằng độ tuyến tớnh cỏc nồng độ khỏc nhau của aflatoxin R đều đạt 0,999 trở nờn. Kết quả này cho thấy sự ổn định của mỏy HPLC là rất cao.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Số húa bởi Trung tõm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIấN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả khảo sỏt thực trạng nhiễm aflatoxin trong một số loại nụng sản thực phẩm
3.1.1. Tỷ lệ nhiễm aflatoxin trong cỏc mẫu phõn tớch
Bảng 3.1. Tỷ lệ mẫu nhiễm độc tố aflatoxin trong cỏc mẫu phõn tớch
Tờn mẫu Số mẫu phõn tớch
Aflatoxin B1 Aflatoxin B2 Aflatoxin G1 Aflatoxin G2 Số mẫu nhiễm Tỷ lệ (%) Số mẫu nhiễm Tỷ lệ (%) Số mẫu nhiễm Tỷ lệ (%) Số mẫu nhiễm Tỷ lệ (%) Ngụ 20 16 80 13 65 9 45 0 0 Lạc 20 16 80 14 70 0 0 0 0 Khụ đỗ tƣơng 20 20 100 12 60 10 50 0 0 Cỏm gạo 16 16 100 8 40 0 0 0 0 Tổng 76 68 89,47 47 61,84 19 25 0 0
Số húa bởi Trung tõm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Ngụ Lạc Khụ đỗ tƣơng Cỏm gạo 80 80 100 100 65 70 60 40 45 0 50 0 0 0 0 0 Tỷ lệ (%) Loại mẫu B1 B2 G1 G2
Hỡnh 3.1. Biểu đồ tỷ lệ mẫu nhiễm độc tố aflatoxin trong cỏc mẫu phõn tớch
Qua bảng 3.1 và biểu đồ cho thấy: Trong tổng số 76 mẫu phõn tớch cú tới 68/76
mẫu nhiễm aflatoxin B1 (chiếm tỉ lệ 89,47%), nhiễm aflatoxin B1 cao nhất 100% ở khụ
đỗ tƣơng và cỏm gạo, ngụ và lạc nhiễm 16/20 mẫu (chiếm tỉ lệ 80%).
Cú 47/76 mẫu nhiễm B2 (chiếm tỉ lệ 61,84%); Trong đú mẫu lạc nhiễm
aflatoxin B2 cao 14/20 mẫu (chiếm tỉ lệ 70%), mẫu ngụ nhiễm 13/20 mẫu (chiếm tỉ lệ
65%), mẫu cỏm gạo và khụ đụ tƣơng nhiễm aflatoxin B2 thấp hơn 8/16 mẫu (chiếm tỉ
lệ 40%) và 12/20 mẫu (chiếm tỉ lệ 60%).
Cú 19/76 mẫu nhiễm G1 (chiếm tỉ lệ 25%). Phỏt hiện nhiễm aflatoxin G1 ở khụ
đỗ tƣơng và ngụ. Ở ngụ cú 9/20 mẫu nhiễm (chiếm tỉ lệ 45%), ở khụ đỗ tƣơng cú 10/20 mẫu nhiễm (chiếm tỉ lệ 50%), cũn ở lạc và cỏm gạo khụng phỏt hiện đƣợc nhiễm
aflatoxin G1.
Khụng cú mẫu nào nhiễm aflatoxin G2.
Nhƣ vậy mức độ nhiễm aflatoxin trong từng loại nụng sản là khỏc nhau, trong