Thí nghiệm đƣợc thiết kế sao cho hoàn thành nhiệm vụ luận văn trong điều kiện cho phép của trang thiết bị phòng thí nghiệm và giới hạn thời gian làm luận văn. Giống
T.reesei nhận đƣợc từ bộ môn công nghệ sinh học, sau đó đƣợc đem hoạt hóa giống môi trƣờng PGA. Sau thời gian 7 ngày (khi bào tử đã mọc khắp bề mặt thạch nghiêng) tiến hành thu dịch huyền phù bằng nƣớc muối sinh lý vô trùng NaCl 0.9%. Dịch huyền phù sau đó đƣợc đem xử lý đột biến tác nhân vật lý (tia UV, microwave). Sau mỗi thời gian xử lý đột biến, dịch huyền phù đƣợc pha loãng ở các nồng độ khác nhau rồi trải ra đĩa petri môi trƣờng PGA để sàng lọc chủng đột biến, chọn trƣờng hợp chiếu xạ thích hợp cho việc khảo sát khả năng phân giải cellulose. Các trƣờng hợp cho đƣờng kính vòng phân giải lớn hơn chủng đối chứng đƣợc chọn để xác định hoạt tính CMCase và lƣợng sinh khối tạo thành. Chọn ra chủng đột biến có hoạt tính CMCase cao hơn chủng đối chứng để xét tính ổn định của chủng đột biến. Tính ổn định đƣợc xét dựa trên hoạt tính CMCase qua các thế hệ. Chủng đột biến sau đó đƣợc khảo sát hoạt tính trên môi trƣờng bán rắn để so sánh khả năng sản xuất cellulase giữa hai môi trƣờng.
Qúa trình thí nghiệm đƣợc tóm tắt dƣới sơ đồ 3.1
1000 1 1 1 CMCase (UI/g) = (AT – AB) xF x x x x
Chƣơng 2: Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
Sơ đồ 3.1: Quy trình thí nghiệm 2.3.1. Tạo chủng đột biến Trichoderma reesei
2.3.1.1. Xử lý đột biến bằng tia UV
Mục tiêu của thí nghiệm là tạo đƣợc giống có khả năng tổng hợp enzyme cellulase cao.
Chủng nấm Trichoderma reesei đƣợc nuôi trên môi trƣờng thạch nghiêng 7 ngày, cho 10ml nƣớc muối sinh lý vô trùng vào ống nghiệm dùng que cấy vô trùng gõ
Chủng T. reesei Xử lý đột biến Tia UV Microwave Xác định tỷ lệ sống sót Xác định khả năng phân giải cellulose Xác định hoạt tính CMCase và hàm lƣợng sinh khối Khảo sát tính ổn định Khảo sát hoạt tính CMCase MT2 MT3 MT2, MT3 MT4 Hoạt hóa giống
Thu dịch huyền phù
Chƣơng 2: Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
nhẹ lên thành cho bào tử rụng ra. Chỉnh mật độ tế bào về 108 tb/ml. Cho dịch bào tử vào curvet thạch anh vô trùng, đậy nắp lại. Đặt curvet chứa dịch nấm vào máy đo mật độ quang ở các thời gian khác nhau ở bƣớc sóng 260nm: 0, 10, 15, 17, 20, 30, 40 (phút). Dịch bào tử sau khi xử lý đƣợc pha loãng bằng nƣớc muối sinh lý vô trùng ở các nồng độ thích hợp 10-1, 10-2, 10-3… sau đó đƣợc trải trên môi trƣờng thạch đĩa PGA, nuôi ở nhiệt độ phòng sau 48h để kiểm tra khả năng sống sót.
2.3.1.2. Xử lý đột biến bằng microwave
Chủng nấm Trichoderma reesei đƣợc nuôi trên môi trƣờng thạch nghiêng 7 ngày, cho 10ml nƣớc muối sinh lý vô trùng vào ống nghiệm dùng que cấy vô trùng gõ nhẹ lên thành cho bào tử rụng ra. Chỉnh mật độ tế bào về 108 tb/ml. Cho dịch bào tử vào đĩa petri vô trùng (chiều cao dịch bào tử trong đĩa khoảng 2mm). Chuyển đĩa petri chứa bào tử vào microwave, mở nắp đĩa, xử lý trên microwave ở các trƣờng hợp chiếu xạ khác nhau: 0, 10, 15, 20, 30 (s). Chiếu xạ đƣợc thực hiện ở lò vi sóng dân dụng (R – 348F), đĩa quay đƣờng kính 275mm, năng lƣợng tối đa 1,6 Kw, tần số 2450 MHZ. Dịch bào tử sau khi xử lý đƣợc pha loãng bằng nƣớc muối sinh lý vô trùng ở các nồng độ thích hợp 10-1
, 10-2, 10-3… sau đó đƣợc trải trên môi trƣờng thạch đĩa PGA, nuôi ở nhiệt độ phòng sau 48h để kiểm tra khả năng sống sót.
2.3.2. Khảo sát khả năng phân giải cellulose
Các trƣờng hợp xử lý đột biến có tỷ lệ sống sót nhỏ hơn so với mẫu đối chứng (không xử lý) đƣợc khảo sát khả năng phân giải cellulose trên môi trƣờng CMC để chọn ra chủng có khả năng phân giải cellulose mạnh.
Phƣơng pháp: Dùng que cấy móc vô trùng gạt nhẹ trên hệ sợi ở từng ống giống
của từng chủng đột biến chuyển sang đĩa petri chứa môi trƣờng cơ chất tƣơng ứng, cắm đầu móc ngƣợc lên mặt thạch thành điểm, sau đó ủ ở nhiệt độ phòng 2 – 3 ngày, sau đó đổ dung dịch lugol lên mặt thạch, quan sát đo đƣờng kính vòng thủy phân. Chủng nào cho đƣờng kính vòng thủy phân lớn hơn mẫu đối chứng sẽ đƣợc làm thí nghiệm tiếp theo.
Chƣơng 2: Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.3. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình sinh trƣởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng Trichoderma reesei thu nhận đƣợc tổng hợp cellulase của các chủng Trichoderma reesei thu nhận đƣợc
Sử dụng môi trƣờng là môi trƣờng dịch khoáng, bổ sung thêm 1% CMC để khảo sát thời gian tăng trƣởng và khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng
Trichoderma reesei thu nhận đƣợc thông qua 2 chỉ tiêu: hàm lƣợng sinh khối tạo thành và hoạt tính cellulase. Các thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần lấy kết quả trung bình.
Chuẩn bị giống: từ các khuẩn lạc riêng rẽ phân lập đƣợc sau khi xử lý đột biến, cấy chuyền từng khuẩn lạc sang môi trƣờng thạch nghiêng PDA, sau n ngày quan sát thấy bề mặt thạch phủ một lớp bào tử, làm dịch huyền phù bằng dung dịch NaCl nồng độ 9g/ l.
Nuôi cấy: cho 100 ml môi trƣờng dịch khoáng (MT1) có bổ sung CMC vào erlen 250 ml bổ sung 2ml dịch huyền phù tế bào chứa bào tử nấm của từng chủng đã xử lý đột biến, đem nuôi ở máy lắc, nhiệt độ phòng, tốc độ lắc 180 rpm. Sau thời gian 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ngày lấy dịch huyền phù đem ly tâm phần cặn lắng đem sấy khô kiểm tra sinh khối. Phần dịch đem kiểm tra hoạt tính CMCase bằng phƣơng pháp DNS, xác định khoảng thời gian (N ngày) tăng trƣởng và khả năng phân giải CMC.
2.3.4. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình sinh tổng hợp cellulase của trên môi trƣờng bán rắn các chủng Trichoderma reesei thu nhận đƣợc của trên môi trƣờng bán rắn các chủng Trichoderma reesei thu nhận đƣợc
Chọn môi trƣờng cám trấu theo nghiên cứu luận án tiến sĩ của thầy Nguyễn Đức Lƣợng. Thành phần môi trƣờng: cám 75%, trấu 24%, (NH4)2SO4: 1%. Cho 2ml giống mật độ 108 trong 10g canh trƣờng. Lên men ở nhiệt độ phòng, chọn độ ẩm ban đầu 60%. Sau khoảng thời gian 2, 3, 4, 5, 6 thu enzyme thô để kiểm tra hoạt tính CMCase. Các thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình.
Thu enzyme: Cho 100ml dung dịch đệm Na-acetate 50mM pH vào 10g canh trƣờng lắc trên máy lắc 180 vòng/ phút trong 2 tiếng. Sau đó lọc thu dịch đệm, đem ly tâm thu dịch ta đƣợc dịch enzyme thô. Dịch enzyme thô đƣợc đem xác định hoạt tính CMCase.
Chƣơng 3: Kết quả
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ 3.1. Xử lý đột biến
3.1.1. Xử lý đột biến bằng tia UV
3.1.1.1. Tỷ lệ sống sót sau khi xử lý đột biến bằng tia UV
Sau khi tiếp xúc với tia cực tím qua lớp curvet thạch anh chiếu xạ với các thời gian khác nhau: 0, 5, 10, 15, 17, 20, 30, 40 (phút) ở bƣớc sóng 260 nm, các bào tử đƣợc pha loãng nồng độ 10-6
, 10-5, 10-4 và trải trên đĩa petri môi trƣờng PGA. Mỗi nồng độ lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình. Sau 3 ngày đếm số lƣợng bào tử tạo thành suy ra tỷ lệ sống sót. Thí nghiệm này nhằm xác định ảnh hƣởng của tia UV (ultraviolet) đến khả năng sống của Trichoderma reesei ở mỗi nồng độ chiếu xạ tƣơng ứng, để chọn ra đƣợc nồng độ chiếu xạ thích hợp nhất cho việc sàng lọc chủng đột biến.
Tỷ lệ gây chết của tia UV càng lớn thì khả năng gây đột biến của nó lên nấm mốc càng cao [13]. Từ kết quả đếm số lƣợng khuẩn lạc tạo thành có tỷ lệ sống sót ứng với mỗi trƣờng hợp chiếu xạ nhƣ sau:
Bảng 3.1: Tỷ lệ sống sót của Trichoderma reesei sau xử lý đột biến bằng tia UV
Thời gian
(phút) 0 15 17 20 30 40
Tỷ lệ sống
sót (%) 100% 84.61 78.46 55.38 49.23 46.15
Số lƣợng bào tử tạo thành của các chủng sau khi xử lý đột biến đƣợc so sánh với chủng đối chứng ta suy ra tỷ lệ sống sót. Khi chiếu UV, tùy theo thời gian chiếu xạ, tỷ lệ sống sót của bào tử cũng thay đổi theo, thời gian chiếu 15 phút tỷ lệ sống sót là 61%. Khi tăng thời gian chiếu xạ lên tỷ lệ sống giảm đi đáng kể. Tăng thời gian chiếu xạ lên 40 phút, tỷ lệ sống sót còn 46.15%. Kết quả cho thấy tỷ lệ sống sót tỷ lệ nghịch với thời gian chiếu xạ. Kết quả tỷ lệ sống sót thể hiện qua đồ thị 3.1:
Chƣơng 3: Kết quả Tỷ lệ sống sót sau xử lý đột biến bằng tia UV 0 20 40 60 80 100 120 0 10 20 30 40 50 Thời gian (phút) T ỷ l ệ s ống
Đồ thị 3.1: Tỷ lệ sống sót của Trichoderma reesei sau xử lý đột biến bằng tia UV
3.1.1.2. Xác định khả năng phân giải cellulose của Trichoderma reesei sau xử lý đột biến bằng tia UV lý đột biến bằng tia UV
Từ kết quả tỷ lệ sống sót thu đƣợc, chọn trƣờng hợp chiếu xạ 40 phút để xét khả năng phân giải cellulose. Kết quả đƣờng kính phân giải cellulose sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng CMC nhƣ sau: chủng gốc (không xử lý đột biến) 2cm, trƣờng hợp xử lý bằng tia UV ở 40 phút thu đƣợc 2 chủng có đƣờng kính phân giải lớn hơn chủng gốc 0.2 cm là 2.2 cm, các chủng còn lại đều có đƣờng kính phân giải bằng chủng gốc. Chủng nguyên thủy và hai chủng có đƣờng kính phân giải lớn hơn đƣợc chọn làm các thí nghiệm tiếp theo và đặt là TC, T1, T2. Ta có kết quả sau: TC: 2.0 cm, T1: 2.2 cm, T2: 2.2 cm.
3.1.2. Xử lý đột biến bằng microwave
3.1.2.1. Tỷ lệ sống sót sau khi xử lý đột biến bằng microwave
Tỷ lệ sống sót đƣợc xác định để tìm ra thời gian chiếu xạ thích hợp cho việc sàng lọc chủng đột biến.
Sau khi bào tử nấm tiếp xúc với vi sóng trong microwave với các liều lƣợng khác nhau: 0, 10, 15, 20, 30 (s) các bào tử đƣợc pha loãng 10-4 và trải trên đĩa petri
Chƣơng 3: Kết quả
môi trƣờng PGA, sau 3 ngày đếm số lƣợng khuẩn lạc tạo thành có kết quả nhƣ bảng 3.2.
Bảng 3.2: Tỷ lệ sống sót của Trichoderma reesei sau xử lý đột biến bằng microwave
Thờigian (s) 0 10 15 20 30
Tỷ lệ sống sót
(%) 100% 10.71 7.14 4.46 1.8
Kết quả tỷ lệ sống sót bằng microwave thể hiện qua đồ thị sau:
Tỷ lệ sống sót sau xử lý đột biến bằng microwave
0 20 40 60 80 100 120 0 5 10 15 20 25 30 35 Thời gian (s) T ỷ lệ s ốn g (% )
Đồ thị 3.2: Tỷ lệ sống sót của Trichoderma reesei sau xử lý đột biến bằng microwave
Kết quả thí nghiệm cho thấy tỷ lệ sống sót tỷ lệ nghịch với thời gian chiếu xạ. Tác động gây chết của bức xạ vi sóng càng lớn chứng tỏ ảnh hƣởng của nó lên bộ gen nấm lớn, do đó khả năng gây đột biến trên bộ gen của Trichoderma reesei cao. Vi sóng tác động rất lớn đến khả năng sống của Trichoderma reesei, chiếu xạ 10s tỷ lệ sống sót là 10.71%. Ở thời gian chiếu xạ 30s tỷ lệ sống chỉ còn 1.8%. Các bào tử sống sót sau khi chiếu xạ 30s đƣợc chọn để xác định khả năng phân giải cellulose.
Chƣơng 3: Kết quả
3.1.2.2. Xác định khả năng phân giải cellulose của Trichoderma reesei sau xử lý đột biến bằng microwave đột biến bằng microwave
Từ kết quả tỷ lệ sống sót thu đƣợc ở trên, chọn trƣờng hợp chiếu xạ 30s (T30) để tiếp tục khảo sát khả năng phân giải cellulose. Sau 3 ngày nuôi cấy trên thạch đĩa CMC, nhỏ lugol, đo đƣờng kính phân giải thu đƣợc một chủng có đƣờng kính phân giải 2.6 cm lớn hơn chủng gốc 0.6 cm, và hai chủng có đƣờng kính phân giải lớn hơn chủng gốc 0.2 cm. Ba chủng có đƣờng kính phân giải lớn hơn chủng gốc đƣợc nghi ngờ có khả năng xảy ra đột biến trên gen sản xuất enzyme cellulase nên đƣợc dùng để làm các thí nghiệm tiếp theo và đặt tên là: T3, T4, T5. Ta có kết quả đƣờng kính phân giải sau 3 ngày nuôi cấy nhƣ sau: T3: 2.6 cm, T4: 2.2 cm, T5: 2.2 cm.
Hình 3.1: Đƣờng kính vòng phân giải của chủng T3 và Tc
3.2. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình sinh trƣởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng Trichoderma reesei thu nhận đƣợc hợp cellulase của các chủng Trichoderma reesei thu nhận đƣợc
Từ các thí nghiệm ở trên ta chọn đƣợc 6 chủng Trichoderma reesei để làm thí nghiệm tiếp theo: Tc, T1, T2, T3, T4, T5. Môi trƣờng sử dụng trong thí nghiệm là môi trƣờng 3 (tham khảo phụ lục 1), lên men trong 7 ngày, hàng ngày kiểm tra lƣợng sinh khối tạo thành và hoạt tính enzyme cellulase. Thí nghiệm lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình. Kết quả hàm lƣợng sinh khối theo nhƣ bảng dƣới đây:
Tc T3
Chƣơng 3: Kết quả
Bảng 3.3: Kết quả thu sinh khối lên men lần 1 (mg/ml)
Thời gian
Chủng
1 (ngày) 2 (ngày) 3 (ngày) 4 (ngày) 5 (ngày) 6 (ngày) 7 (ngày)
TC 1.13 1.26 1.91 1.545 1.525 2.32 1.26 T1 1.21 1.5 1.953 1.565 1.495 2.995 0.31 T2 1.43 1.86 1.84 1.81 1.39 2.14 1.29 T3 1.33 1.42 1.653 1.36 1.415 1.99 1.36 T4 1.09 1.99 1.34 2.19 1.46 2.16 1.66 T5 1.18 1.35 1.47 2.12 1.71 1.89 1.87
Hàm lƣợng sinh khối của 6 chủng sau 7 ngày nuôi cấy đƣợc thể hiện dƣới đồ thị sau:
Hàm lượng sinh khối
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 1 2 3 4 5 6 7
Thời gian (ngày)
K h ố i l ư ợ n g ( m g ) Tc T1 T2 T3 T4 T5
Chƣơng 3: Kết quả
Hàm lƣợng sinh khối của các chủng sau 7 ngày chênh lệch nhau không nhiều. Ở ngày thứ 6 hàm lƣợng sinh khối của chủng T1 cao hơn hẳn các chủng khác (2.995mg) nhƣng đến ngày thứ 7 hàm lƣợng sinh khối của chủng này lại giảm mạnh (chỉ còn 0.31g) nguyên nhân có thể do sai số trong quá trình thao tác. Khi lấy dịch canh trƣờng đi ly tâm thu sinh khối có thể erlen chƣa đƣợc lắc kỹ, hệ sợi nấm trong canh trƣờng chƣa đƣợc phân bố đồng đều dẫn đến hàm lƣợng sinh khối tăng cao hoặc giảm mạnh (đối với chủng T1 ở ngày thứ 6 và ngày thứ 7).
Nhìn chung sinh khối tế bào tăng trong 3 ngày đầu, từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 5 lƣợng sinh khối tƣơng đối ổn định sinh khối tế bào tăng chậm. Đến ngày thứ 6 bào tử bắt đầu hình thành. Đến ngày thứ 7 hàm lƣợng sinh khối giảm do nguồn dinh dƣỡng trong môi trƣờng cạn kiệt.
Hình 3.2: Dịch enzyme thô thu đƣợc khi nuôi trên môi trƣờng lỏng
Dịch enzyme sau khi ly tâm đƣợc đem xác định hoạt tính CMCase (theo 2.2.2). Thí nghiệm lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình. Một đơn vị hoạt tính CMCase đƣợc định nghĩa là số lƣợng enzyme cần thiết để giải phóng ra đƣờng khử (glusoce) ở tốc độ µmol/phút dƣới các điều kiện thực nghiệm. Xác định đƣợc hoạt tính CMCase ta có thể so sánh khả năng sản xuất enzyme cellulase giữa các chủng sau khi xử lý đột biến và chủng gốc đồng thời xác định đƣợc thời gian lên men thích hợp để thu đƣợc lƣợng enzyme lớn nhất. Hoạt tính CMCase của các chủng Trichoderma reesei sau khi xử lý đột biến, nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng (phụ lục 1) thể hiện rõ hơn theo bảng 3.4.
Chƣơng 3: Kết quả
Bảng 3.4: Hoạt tính CMCase của Trichoderma reesei sau xử lý đột biến nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng (UI/g)
Thời gian
Chủng
1 (ngày) 2 (ngày) 3 (ngày) 4 (ngày) 5 (ngày) 6 (ngày) 7 (ngày)
TC 0.0278 0.0281 0.0411 0.0298 0.035 0.024 0.011 T1 0.0144 0.0665 0.0956 0.055 0.047 0.0273 0.033 T2 0.0944 0.0386 0.084 0.0725 0.034 0.052 0.037 T3 0.061 0.914 3.29 2.33 2.496 3.139 2.4165 T4 0.0376 0.057 0.1026 0.061 0.067 0.077 0.033 T5 0.0155 0.094 0.177 0.122 0.084 0.0722 0.039
Ngày thứ nhất, hoạt tính enzyme của T. reesei còn yếu do nấm mốc sử dụng chất dinh dƣỡng có sẵn trong môi trƣờng nên tiết ra ít enzyme. Sau đó hoạt tính enzyme của các chủng tăng dần, cao nhất là vào ngày thứ 3 là giai đoạn đầu pha cân bằng. Chủng T3 hoạt tính ngày thứ 3 là 3.29 UI/g, sau đó hoạt tính giảm dần, đến ngày