của trên môi trƣờng bán rắn các chủng Trichoderma reesei thu nhận đƣợc
Chọn môi trƣờng cám trấu theo nghiên cứu luận án tiến sĩ của thầy Nguyễn Đức Lƣợng. Thành phần môi trƣờng: cám 75%, trấu 24%, (NH4)2SO4: 1%. Cho 2ml giống mật độ 108 trong 10g canh trƣờng. Lên men ở nhiệt độ phòng, chọn độ ẩm ban đầu 60%. Sau khoảng thời gian 2, 3, 4, 5, 6 thu enzyme thô để kiểm tra hoạt tính CMCase. Các thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình.
Thu enzyme: Cho 100ml dung dịch đệm Na-acetate 50mM pH vào 10g canh trƣờng lắc trên máy lắc 180 vòng/ phút trong 2 tiếng. Sau đó lọc thu dịch đệm, đem ly tâm thu dịch ta đƣợc dịch enzyme thô. Dịch enzyme thô đƣợc đem xác định hoạt tính CMCase.
Chƣơng 3: Kết quả
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ 3.1. Xử lý đột biến
3.1.1. Xử lý đột biến bằng tia UV
3.1.1.1. Tỷ lệ sống sót sau khi xử lý đột biến bằng tia UV
Sau khi tiếp xúc với tia cực tím qua lớp curvet thạch anh chiếu xạ với các thời gian khác nhau: 0, 5, 10, 15, 17, 20, 30, 40 (phút) ở bƣớc sóng 260 nm, các bào tử đƣợc pha loãng nồng độ 10-6
, 10-5, 10-4 và trải trên đĩa petri môi trƣờng PGA. Mỗi nồng độ lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình. Sau 3 ngày đếm số lƣợng bào tử tạo thành suy ra tỷ lệ sống sót. Thí nghiệm này nhằm xác định ảnh hƣởng của tia UV (ultraviolet) đến khả năng sống của Trichoderma reesei ở mỗi nồng độ chiếu xạ tƣơng ứng, để chọn ra đƣợc nồng độ chiếu xạ thích hợp nhất cho việc sàng lọc chủng đột biến.
Tỷ lệ gây chết của tia UV càng lớn thì khả năng gây đột biến của nó lên nấm mốc càng cao [13]. Từ kết quả đếm số lƣợng khuẩn lạc tạo thành có tỷ lệ sống sót ứng với mỗi trƣờng hợp chiếu xạ nhƣ sau:
Bảng 3.1: Tỷ lệ sống sót của Trichoderma reesei sau xử lý đột biến bằng tia UV
Thời gian
(phút) 0 15 17 20 30 40
Tỷ lệ sống
sót (%) 100% 84.61 78.46 55.38 49.23 46.15
Số lƣợng bào tử tạo thành của các chủng sau khi xử lý đột biến đƣợc so sánh với chủng đối chứng ta suy ra tỷ lệ sống sót. Khi chiếu UV, tùy theo thời gian chiếu xạ, tỷ lệ sống sót của bào tử cũng thay đổi theo, thời gian chiếu 15 phút tỷ lệ sống sót là 61%. Khi tăng thời gian chiếu xạ lên tỷ lệ sống giảm đi đáng kể. Tăng thời gian chiếu xạ lên 40 phút, tỷ lệ sống sót còn 46.15%. Kết quả cho thấy tỷ lệ sống sót tỷ lệ nghịch với thời gian chiếu xạ. Kết quả tỷ lệ sống sót thể hiện qua đồ thị 3.1:
Chƣơng 3: Kết quả Tỷ lệ sống sót sau xử lý đột biến bằng tia UV 0 20 40 60 80 100 120 0 10 20 30 40 50 Thời gian (phút) T ỷ l ệ s ống
Đồ thị 3.1: Tỷ lệ sống sót của Trichoderma reesei sau xử lý đột biến bằng tia UV
3.1.1.2. Xác định khả năng phân giải cellulose của Trichoderma reesei sau xử lý đột biến bằng tia UV lý đột biến bằng tia UV
Từ kết quả tỷ lệ sống sót thu đƣợc, chọn trƣờng hợp chiếu xạ 40 phút để xét khả năng phân giải cellulose. Kết quả đƣờng kính phân giải cellulose sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng CMC nhƣ sau: chủng gốc (không xử lý đột biến) 2cm, trƣờng hợp xử lý bằng tia UV ở 40 phút thu đƣợc 2 chủng có đƣờng kính phân giải lớn hơn chủng gốc 0.2 cm là 2.2 cm, các chủng còn lại đều có đƣờng kính phân giải bằng chủng gốc. Chủng nguyên thủy và hai chủng có đƣờng kính phân giải lớn hơn đƣợc chọn làm các thí nghiệm tiếp theo và đặt là TC, T1, T2. Ta có kết quả sau: TC: 2.0 cm, T1: 2.2 cm, T2: 2.2 cm.
3.1.2. Xử lý đột biến bằng microwave
3.1.2.1. Tỷ lệ sống sót sau khi xử lý đột biến bằng microwave
Tỷ lệ sống sót đƣợc xác định để tìm ra thời gian chiếu xạ thích hợp cho việc sàng lọc chủng đột biến.
Sau khi bào tử nấm tiếp xúc với vi sóng trong microwave với các liều lƣợng khác nhau: 0, 10, 15, 20, 30 (s) các bào tử đƣợc pha loãng 10-4 và trải trên đĩa petri
Chƣơng 3: Kết quả
môi trƣờng PGA, sau 3 ngày đếm số lƣợng khuẩn lạc tạo thành có kết quả nhƣ bảng 3.2.
Bảng 3.2: Tỷ lệ sống sót của Trichoderma reesei sau xử lý đột biến bằng microwave
Thờigian (s) 0 10 15 20 30
Tỷ lệ sống sót
(%) 100% 10.71 7.14 4.46 1.8
Kết quả tỷ lệ sống sót bằng microwave thể hiện qua đồ thị sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tỷ lệ sống sót sau xử lý đột biến bằng microwave
0 20 40 60 80 100 120 0 5 10 15 20 25 30 35 Thời gian (s) T ỷ lệ s ốn g (% )
Đồ thị 3.2: Tỷ lệ sống sót của Trichoderma reesei sau xử lý đột biến bằng microwave
Kết quả thí nghiệm cho thấy tỷ lệ sống sót tỷ lệ nghịch với thời gian chiếu xạ. Tác động gây chết của bức xạ vi sóng càng lớn chứng tỏ ảnh hƣởng của nó lên bộ gen nấm lớn, do đó khả năng gây đột biến trên bộ gen của Trichoderma reesei cao. Vi sóng tác động rất lớn đến khả năng sống của Trichoderma reesei, chiếu xạ 10s tỷ lệ sống sót là 10.71%. Ở thời gian chiếu xạ 30s tỷ lệ sống chỉ còn 1.8%. Các bào tử sống sót sau khi chiếu xạ 30s đƣợc chọn để xác định khả năng phân giải cellulose.
Chƣơng 3: Kết quả
3.1.2.2. Xác định khả năng phân giải cellulose của Trichoderma reesei sau xử lý đột biến bằng microwave đột biến bằng microwave
Từ kết quả tỷ lệ sống sót thu đƣợc ở trên, chọn trƣờng hợp chiếu xạ 30s (T30) để tiếp tục khảo sát khả năng phân giải cellulose. Sau 3 ngày nuôi cấy trên thạch đĩa CMC, nhỏ lugol, đo đƣờng kính phân giải thu đƣợc một chủng có đƣờng kính phân giải 2.6 cm lớn hơn chủng gốc 0.6 cm, và hai chủng có đƣờng kính phân giải lớn hơn chủng gốc 0.2 cm. Ba chủng có đƣờng kính phân giải lớn hơn chủng gốc đƣợc nghi ngờ có khả năng xảy ra đột biến trên gen sản xuất enzyme cellulase nên đƣợc dùng để làm các thí nghiệm tiếp theo và đặt tên là: T3, T4, T5. Ta có kết quả đƣờng kính phân giải sau 3 ngày nuôi cấy nhƣ sau: T3: 2.6 cm, T4: 2.2 cm, T5: 2.2 cm.
Hình 3.1: Đƣờng kính vòng phân giải của chủng T3 và Tc
3.2. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình sinh trƣởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng Trichoderma reesei thu nhận đƣợc hợp cellulase của các chủng Trichoderma reesei thu nhận đƣợc
Từ các thí nghiệm ở trên ta chọn đƣợc 6 chủng Trichoderma reesei để làm thí nghiệm tiếp theo: Tc, T1, T2, T3, T4, T5. Môi trƣờng sử dụng trong thí nghiệm là môi trƣờng 3 (tham khảo phụ lục 1), lên men trong 7 ngày, hàng ngày kiểm tra lƣợng sinh khối tạo thành và hoạt tính enzyme cellulase. Thí nghiệm lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình. Kết quả hàm lƣợng sinh khối theo nhƣ bảng dƣới đây:
Tc T3
Chƣơng 3: Kết quả
Bảng 3.3: Kết quả thu sinh khối lên men lần 1 (mg/ml)
Thời gian
Chủng
1 (ngày) 2 (ngày) 3 (ngày) 4 (ngày) 5 (ngày) 6 (ngày) 7 (ngày)
TC 1.13 1.26 1.91 1.545 1.525 2.32 1.26 T1 1.21 1.5 1.953 1.565 1.495 2.995 0.31 T2 1.43 1.86 1.84 1.81 1.39 2.14 1.29 T3 1.33 1.42 1.653 1.36 1.415 1.99 1.36 T4 1.09 1.99 1.34 2.19 1.46 2.16 1.66 T5 1.18 1.35 1.47 2.12 1.71 1.89 1.87
Hàm lƣợng sinh khối của 6 chủng sau 7 ngày nuôi cấy đƣợc thể hiện dƣới đồ thị sau:
Hàm lượng sinh khối
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 1 2 3 4 5 6 7
Thời gian (ngày)
K h ố i l ư ợ n g ( m g ) Tc T1 T2 T3 T4 T5
Chƣơng 3: Kết quả
Hàm lƣợng sinh khối của các chủng sau 7 ngày chênh lệch nhau không nhiều. Ở ngày thứ 6 hàm lƣợng sinh khối của chủng T1 cao hơn hẳn các chủng khác (2.995mg) nhƣng đến ngày thứ 7 hàm lƣợng sinh khối của chủng này lại giảm mạnh (chỉ còn 0.31g) nguyên nhân có thể do sai số trong quá trình thao tác. Khi lấy dịch canh trƣờng đi ly tâm thu sinh khối có thể erlen chƣa đƣợc lắc kỹ, hệ sợi nấm trong canh trƣờng chƣa đƣợc phân bố đồng đều dẫn đến hàm lƣợng sinh khối tăng cao hoặc giảm mạnh (đối với chủng T1 ở ngày thứ 6 và ngày thứ 7).
Nhìn chung sinh khối tế bào tăng trong 3 ngày đầu, từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 5 lƣợng sinh khối tƣơng đối ổn định sinh khối tế bào tăng chậm. Đến ngày thứ 6 bào tử bắt đầu hình thành. Đến ngày thứ 7 hàm lƣợng sinh khối giảm do nguồn dinh dƣỡng trong môi trƣờng cạn kiệt.
Hình 3.2: Dịch enzyme thô thu đƣợc khi nuôi trên môi trƣờng lỏng
Dịch enzyme sau khi ly tâm đƣợc đem xác định hoạt tính CMCase (theo 2.2.2). Thí nghiệm lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình. Một đơn vị hoạt tính CMCase đƣợc định nghĩa là số lƣợng enzyme cần thiết để giải phóng ra đƣờng khử (glusoce) ở tốc độ µmol/phút dƣới các điều kiện thực nghiệm. Xác định đƣợc hoạt tính CMCase ta có thể so sánh khả năng sản xuất enzyme cellulase giữa các chủng sau khi xử lý đột biến và chủng gốc đồng thời xác định đƣợc thời gian lên men thích hợp để thu đƣợc lƣợng enzyme lớn nhất. Hoạt tính CMCase của các chủng Trichoderma reesei sau khi xử lý đột biến, nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng (phụ lục 1) thể hiện rõ hơn theo bảng 3.4.
Chƣơng 3: Kết quả
Bảng 3.4: Hoạt tính CMCase của Trichoderma reesei sau xử lý đột biến nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng (UI/g)
Thời gian (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chủng
1 (ngày) 2 (ngày) 3 (ngày) 4 (ngày) 5 (ngày) 6 (ngày) 7 (ngày)
TC 0.0278 0.0281 0.0411 0.0298 0.035 0.024 0.011 T1 0.0144 0.0665 0.0956 0.055 0.047 0.0273 0.033 T2 0.0944 0.0386 0.084 0.0725 0.034 0.052 0.037 T3 0.061 0.914 3.29 2.33 2.496 3.139 2.4165 T4 0.0376 0.057 0.1026 0.061 0.067 0.077 0.033 T5 0.0155 0.094 0.177 0.122 0.084 0.0722 0.039
Ngày thứ nhất, hoạt tính enzyme của T. reesei còn yếu do nấm mốc sử dụng chất dinh dƣỡng có sẵn trong môi trƣờng nên tiết ra ít enzyme. Sau đó hoạt tính enzyme của các chủng tăng dần, cao nhất là vào ngày thứ 3 là giai đoạn đầu pha cân bằng. Chủng T3 hoạt tính ngày thứ 3 là 3.29 UI/g, sau đó hoạt tính giảm dần, đến ngày thứ 7 hoạt tính chỉ còn 2.4165 UI/g.
Chủng T3 thu đƣợc hoạt tính cao nhất, cao hơn chủng đối chứng 80 lần ở ngày thứ 3. Chủng đối chứng Tc và chủng xử lý đột biến bằng microwave ở 30 giây T3 đƣợc chọn để làm các thí nghiệm tiếp theo. Có thể nói đã tạo thành công chủng đột biến sản xuất cellulase cao hơn chủng đối chứng là chủng T3. Các chủng xử lý đột biến bằng tia UV (T1, T2) sản xuất lƣợng enzyme cellulase cao hơn chủng gốc không đáng kể. Nhƣ vậy phƣơng pháp xử lý đột biến bằng tia UV chƣa đạt hiệu quả. Để đạt đƣợc kết quả cao cần tăng thời gian xử lý hoặc thay đổi phƣơng pháp chiếu xạ (chiếu trực tiếp tia UV lên bào tử nấm). Kết quả hoạt tính CMCase đƣợc biểu thị dƣới đồ thị 3.4.
Chƣơng 3: Kết quả Hoạt tính CMCase (3, 3.29) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 0 2 4 6 8
Thời gian (ngày)
H o ạt tí n h C M C as e (U I/g ) Tc T1 T2 T3 T4 T5
Đồ thị 3.4: Hoạt tính CMCase của Trichoderma reesei sau xử lý đột biến nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng
Hình 3.3: Canh trƣờng lên men sau 2 ngày
3.3. Kiểm tra tính ổn định của chủng đột biến
Chủng đột biến có hoạt tính cao đƣợc chọn để kiểm tra tính ổn định. Tính ổn định đƣợc kiểm tra thông qua khả năng phân giải cellulose trên môi trƣờng thạch đĩa CMC và hoạt tính CMCase trên môi trƣờng lỏng qua nhiều thế hệ.
Chƣơng 3: Kết quả
Khảo sát khả năng phân giải cellulose trên môi trường thạch đĩa CMC qua 9 thế hệ
Từ thế hệ giống thứ nhất (F1) của chủng Tc và T3 cấy chuyền qua nhiều lần trên môi trƣờng thạch đĩa PGA ta thu đƣợc các thế hệ tiếp theo của 2 chủng này. Từ mỗi thế hệ tƣơng ứng cấy ra môi trƣờng thạch đĩa CMC (nhƣ 2.3.3). Sau 3 ngày nuôi cấy, đem nhỏ lugol và đo đƣờng kính phân giải kết quả thu đƣợc cũng giống với thế hệ thứ nhất: Tc: 2cm, T3: 2,6 cm. Nhƣ vậy có thể kết luận sơ bộ là chủng đột biến có tính ổn định. Tuy nhiên sự khảo sát khả năng phân giải cellulose qua việc đo đƣờng kính phân giải chỉ mang tính chất định tính. Để khẳng định chắc chắn hơn tính ổn định của chủng đột biến ta cần khảo sát hoạt tính CMCase trên môi trƣờng lỏng.
Khảo sát khả năng tổng hợp cellulase qua 9 thế hệ
Do hạn chế về mặt thời gian, trong bài luận văn này chỉ khảo sát 2 thế hệ F4 và F9. Giống đƣợc cấy chuyền liên tiếp nhiều lần trên thạch nghiêng PGA ta thu đƣợc các thế hệ giống khác nhau (từ F1 đến F9). Lấy giống đời F4 và đời F9 lên men trên môi trƣờng 3 (bảng 3.1), trong thời gian 3, 4, 5, 6 ngày. Thu lấy dịch môi trƣờng đem ly tâm, thu dịch ly tâm đi xác định hoạt tính CMCase. Ta thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
Bảng 3.5: Hoạt tính CMCase của Trichoderma reesei thế hệ thứ 4
Thời gian Chủng
3 (ngày) 4 (ngày) 5 (ngày) 6 (ngày)
TC 0.0415 0.031 0.035 0.0136
T3 3.31 2.35 2.43 3.135
Bảng 3.6: Hoạt tính CMCase của Trichoderma reesei thế hệ thứ 9
Thời gian Chủng
3 (ngày) 4 (ngày) 5 (ngày) 6 (ngày)
TC 0.044 0.031 0.0301 0.0213
Chƣơng 3: Kết quả
Hình 3.3: Dịch enzyme thô thu đƣợc từ môi trƣờng lên men bán rắn
Khảo sát hoạt tính CMCase của Trichoderma reesei T3 thế hệ thứ 4 và thế hệ thứ 9 hoạt tính CMCase ngày thứ 3 dao động trong khoảng 3.31 – 3.33 UI/g, không khác biệt nhiều so với hoạt tính của thế hệ thứ nhất là 3.29 UI/g. So sánh hoạt tính enzyme các ngày 4, 5, 6 của hai chủng T3, Tc qua các thế hệ ta cũng đƣợc kết quả tƣơng tự. Nhìn chung hoạt tính CMCase sau 9 thế hệ là ổn định. Do đó chủng đột biến có tính ổn định.
3.4. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian đến khả năng tổng hợp cellulase của chủng đột biến trên môi trƣờng bán rắn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.4: Sự phát triển cuả Trichoderma reesei môi trƣờng bán rắn sau 2 ngày lên men
Chọn môi trƣờng cám trấu theo nghiên cứu luận án tiến sĩ của thầy Nguyễn Đức Lƣợng. Thành phần môi trƣờng: cám 75%, trấu 24%, (NH4)2SO4: 1%. Lên men ở nhiệt độ phòng, chọn độ ẩm ban đầu 60%. Sau khoảng thời gian 2, 3, 4, 5, 6 thu enzyme thô
T3 Tc
Chƣơng 3: Kết quả
để kiểm tra hoạt tính CMCase. Hoạt tính CMCase thu đƣợc trên môi trƣờng bán rắn thu đƣợc nhƣ bảng sau:
Bảng 3.7: Hoạt tính CMCase (UI/g) của Tc, T3 trên môi trƣờng bán rắn.
Thời gian
Chủng
2 (ngày) 3 (ngày) 4 (ngày) 5 (ngày) 6 (ngày)
Tc 2.83 4.24 4.2 3.55 3.12
T3 12.85 16.2 15.11 13.55 13.115
Nhìn chung hoạt tính enzyme ở cả hai chủng tƣơng đối thấp ở ngày thứ 2 đến ngày thứ 3 hoạt tính đạt cực đại T3: 16.2 UI/g, Tc: 4.24 UI/g. Và sau đó ngày 4, 5, 6, 7 hoạt tính giảm dần. Chủng T3 có hoạt tính cao hơn chủng Tc, cụ thể ngày thứ 3 hoạt tính cao hơn 3.82 lần.
Từ bảng 3.4 và bảng 3.7 có thể thấy hoạt tính CMCase của Trichoderma reesei
khi nuôi cấy trên môi trƣờng bán rắn cao hơn khi nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng. Hoạt tính CMCase của T3 môi trƣờng bán rắn ngày thứ 3 là 16.2 UI/g, trong khi đó môi trƣờng lỏng là 3.29 UI/g.
Hoạt tính CMCase đƣợc thể hiện rõ hơn qua đồ thị sau:
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 1 2 3 4 5 6 7
Thời gian (ngày)
H oạ t tí nh ( U I/ g) Tc T3
Chƣơng 4: Bàn luận và kiến nghị
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Tia UV khi chiếu trực tiếp lên bào tử nấm có tác động mạnh mẽ lên DNA và tỷ lệ gây chết cao. Theo Long Hao, Wang Tianhong, Zhang Yingkuan [15] các bào tử đƣợc đặt dƣới ngọn đèn UV 25 W ở khoảng cách 45cm trong thời gian 120 giây tỷ lệ sống sót ít hơn 20%. Trong thí nghiệm này, bào tử nấm đƣợc chiếu tia UV gián tiếp