Định nghĩa:
Một đơn vị hoạt tính CMCase đƣợc định nghĩa là số lƣợng enzymecần thiết để giải phóng ra đƣờng khử (glusoce) ở tốc độ µmol/phút dƣới các điều kiện thực nghiệm.
Nguyên tắc
Phƣơng pháp này dựa trên sự thủy giải CMC (carboxy methyl cellulose) bằng enzyme ở pH 5.0 và 400C. Sau phản ứng thủy phân sẽ tạo ra một lƣợng đƣờng khử, đƣờng khử sẽ phản ứng với axit 3,5 – dinitrosalicylic và đƣợc xác định bằng máy đo mật độ quang ở bƣớc sóng 540nm.
Cách thực hiện
Phản ứng với enzyme
Hút 1 mL dung dịch mẫu vào ống nghiệm và để ổn định nhiệt độ ở 400C trong 5 phút. Cũng để dung dịch cơ chất ổn định ở nhiệt độ này trong 5 phút. Thêm 1 mL dung dịch cơ chất vào ống nghiệm đựng dung dịch mẫu và lắc đều. Để phản ứng xảy ra trong khoảng chính xác 400C trong 10 phút. Thêm vào 4 mL dung dịch lactose – DNS, lắc đều thật kỹ để ngừng phản ứng enzyme. Để tránh sự bốc hơi nƣớc, dùng một miếng nilon hay parfilm dán lấy miệng ống nghiệm và đặt ống nghiệm vào nƣớc sôi trong 15 phút. Đƣa ống nghiệm về nhiệt độ phòng bằng cách đặt ống nghiệm vào một nồi nƣớc lạnh. Đo độ hấp thu OD ở bƣớc sóng 540 nm. Dùng nƣớc cất làm mẫu đối chứng (AT).
Phản ứng thử không
Hút 1 mL dung dịch mẫu vào ống nghiệm và để ổn định nhiệt độ ở 400C trong 5 phút. Cũng để dung dịch cơ chất ổn định ở nhiệt độ này trong 5 phút. Thêm vào 4 mL dung dịch lactose DNS, lắc đều. Thêm 1 mL dung dịch cơ chất vào ống nghiệm đựng dung dịch mẫu và lắc đều. Để tránh sự bốc hơi nƣớc, dùng một miếng nilon hay parafilm dán lấy miệng ống nghiệm và đặt ống nghiệm vào nƣớc sôi trong 15 phút.
Chƣơng 2: Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
Đƣa ống nghiệm về nhiệt độ phòng bằng cách đặt ống nghiệm vào nồi nƣớc lạnh. Đo độ hấp thu OD ở bƣớc sóng 540 nm. Dùng nƣớc cất làm mẫu đối chứng (AB).
Phản ứng của các dung dịch đƣờng glucose chuẩn và nƣớc cất
Hút lần lƣợt 1 mL các dung dịch đƣờng glucose chuẩn vào các ống nghiệm. Thêm vào 1 mL dung dịch cơ chất và lắc đều. Thêm vào 4 mL dung dịch lactose DNS, lắc đều. Để tránh sự bốc hơi nƣớc, dùng một miếng nilon hay parafilm dán lấy miệng ống nghiệm và đặt ống nghiệm vào nƣớc sôi trong 15 phút. Đƣa ống nghiệm về nhiệt độ phòng bằng cách đặt ống nghiệm vào nồi nƣớc lạnh. Đo độ hấp thu OD ở bƣớc sóng 540 nm. Dùng nƣớc cất làm mẫu đối chứng (AG).
Đối với nƣớc cất: làm tƣơng tự nhƣ trên. Thay dung dịch glucose chuẩn bằng nƣớc cất. Đo độ hấp thu ở bƣớc sóng 540 nm (Aw).
Tính toán
Tính hệ số glucose
- Hiệu chuẩn độ hấp thu OD của dung dịch đƣờng glucose chuẩn bằng cách: AG – AW.
- Đối với mỗi nồng độ pha loãng, dựng đƣờng biểu diễn sự biến thiên sự biến giữa OD và nồng độ glucose (mg/mL).
- Chia nồng độ (mg/mL) cho độ hấp thu OD của mỗi dung dịch đƣờng chuẩn để thu đƣợc giá trị hệ số glucose (mg/mL), tính giá trị hệ số trung bình.
- Hệ số glucose đƣợc viết lại bằng công thức:
Trong đó: F: hệ số glucose
CG: nồng độ dung dịch glucose chuẩn (mg/mL) AG: độ hấp thu OD của dung dịch glucose chuẩn AW: độ hấp thu OD của phản ứng với nƣớc cất.
CG (mg/mL) F = AG - AW CG (mg/mL) F = AG - AW
Chƣơng 2: Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
Xác định hoạt tính enzyme
Trong đó:
AT: độ hấp thu OD của dung dịch enzyme AB: độ hấp thu OD của phản ứng
F: hệ số glucose (mg/mL) 1000: chuyển từ mg sang µg
180: trọng lƣợng phân tử glucose, đổi từ µg sang µmol 10 phút: thời gian phản ứng
C: nồng độ dung dịch mẫu (g/mL).