Chủng đột biến có hoạt tính cao đƣợc chọn để kiểm tra tính ổn định. Tính ổn định đƣợc kiểm tra thông qua khả năng phân giải cellulose trên môi trƣờng thạch đĩa CMC và hoạt tính CMCase trên môi trƣờng lỏng qua nhiều thế hệ.
Chƣơng 3: Kết quả
Khảo sát khả năng phân giải cellulose trên môi trường thạch đĩa CMC qua 9 thế hệ
Từ thế hệ giống thứ nhất (F1) của chủng Tc và T3 cấy chuyền qua nhiều lần trên môi trƣờng thạch đĩa PGA ta thu đƣợc các thế hệ tiếp theo của 2 chủng này. Từ mỗi thế hệ tƣơng ứng cấy ra môi trƣờng thạch đĩa CMC (nhƣ 2.3.3). Sau 3 ngày nuôi cấy, đem nhỏ lugol và đo đƣờng kính phân giải kết quả thu đƣợc cũng giống với thế hệ thứ nhất: Tc: 2cm, T3: 2,6 cm. Nhƣ vậy có thể kết luận sơ bộ là chủng đột biến có tính ổn định. Tuy nhiên sự khảo sát khả năng phân giải cellulose qua việc đo đƣờng kính phân giải chỉ mang tính chất định tính. Để khẳng định chắc chắn hơn tính ổn định của chủng đột biến ta cần khảo sát hoạt tính CMCase trên môi trƣờng lỏng.
Khảo sát khả năng tổng hợp cellulase qua 9 thế hệ
Do hạn chế về mặt thời gian, trong bài luận văn này chỉ khảo sát 2 thế hệ F4 và F9. Giống đƣợc cấy chuyền liên tiếp nhiều lần trên thạch nghiêng PGA ta thu đƣợc các thế hệ giống khác nhau (từ F1 đến F9). Lấy giống đời F4 và đời F9 lên men trên môi trƣờng 3 (bảng 3.1), trong thời gian 3, 4, 5, 6 ngày. Thu lấy dịch môi trƣờng đem ly tâm, thu dịch ly tâm đi xác định hoạt tính CMCase. Ta thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
Bảng 3.5: Hoạt tính CMCase của Trichoderma reesei thế hệ thứ 4
Thời gian Chủng
3 (ngày) 4 (ngày) 5 (ngày) 6 (ngày)
TC 0.0415 0.031 0.035 0.0136
T3 3.31 2.35 2.43 3.135
Bảng 3.6: Hoạt tính CMCase của Trichoderma reesei thế hệ thứ 9
Thời gian Chủng
3 (ngày) 4 (ngày) 5 (ngày) 6 (ngày)
TC 0.044 0.031 0.0301 0.0213
Chƣơng 3: Kết quả
Hình 3.3: Dịch enzyme thô thu đƣợc từ môi trƣờng lên men bán rắn
Khảo sát hoạt tính CMCase của Trichoderma reesei T3 thế hệ thứ 4 và thế hệ thứ 9 hoạt tính CMCase ngày thứ 3 dao động trong khoảng 3.31 – 3.33 UI/g, không khác biệt nhiều so với hoạt tính của thế hệ thứ nhất là 3.29 UI/g. So sánh hoạt tính enzyme các ngày 4, 5, 6 của hai chủng T3, Tc qua các thế hệ ta cũng đƣợc kết quả tƣơng tự. Nhìn chung hoạt tính CMCase sau 9 thế hệ là ổn định. Do đó chủng đột biến có tính ổn định.
3.4. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian đến khả năng tổng hợp cellulase của chủng đột biến trên môi trƣờng bán rắn
Hình 3.4: Sự phát triển cuả Trichoderma reesei môi trƣờng bán rắn sau 2 ngày lên men
Chọn môi trƣờng cám trấu theo nghiên cứu luận án tiến sĩ của thầy Nguyễn Đức Lƣợng. Thành phần môi trƣờng: cám 75%, trấu 24%, (NH4)2SO4: 1%. Lên men ở nhiệt độ phòng, chọn độ ẩm ban đầu 60%. Sau khoảng thời gian 2, 3, 4, 5, 6 thu enzyme thô
T3 Tc
Chƣơng 3: Kết quả
để kiểm tra hoạt tính CMCase. Hoạt tính CMCase thu đƣợc trên môi trƣờng bán rắn thu đƣợc nhƣ bảng sau:
Bảng 3.7: Hoạt tính CMCase (UI/g) của Tc, T3 trên môi trƣờng bán rắn.
Thời gian
Chủng
2 (ngày) 3 (ngày) 4 (ngày) 5 (ngày) 6 (ngày)
Tc 2.83 4.24 4.2 3.55 3.12
T3 12.85 16.2 15.11 13.55 13.115
Nhìn chung hoạt tính enzyme ở cả hai chủng tƣơng đối thấp ở ngày thứ 2 đến ngày thứ 3 hoạt tính đạt cực đại T3: 16.2 UI/g, Tc: 4.24 UI/g. Và sau đó ngày 4, 5, 6, 7 hoạt tính giảm dần. Chủng T3 có hoạt tính cao hơn chủng Tc, cụ thể ngày thứ 3 hoạt tính cao hơn 3.82 lần.
Từ bảng 3.4 và bảng 3.7 có thể thấy hoạt tính CMCase của Trichoderma reesei
khi nuôi cấy trên môi trƣờng bán rắn cao hơn khi nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng. Hoạt tính CMCase của T3 môi trƣờng bán rắn ngày thứ 3 là 16.2 UI/g, trong khi đó môi trƣờng lỏng là 3.29 UI/g.
Hoạt tính CMCase đƣợc thể hiện rõ hơn qua đồ thị sau:
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 1 2 3 4 5 6 7
Thời gian (ngày)
H oạ t tí nh ( U I/ g) Tc T3
Chƣơng 4: Bàn luận và kiến nghị
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Tia UV khi chiếu trực tiếp lên bào tử nấm có tác động mạnh mẽ lên DNA và tỷ lệ gây chết cao. Theo Long Hao, Wang Tianhong, Zhang Yingkuan [15] các bào tử đƣợc đặt dƣới ngọn đèn UV 25 W ở khoảng cách 45cm trong thời gian 120 giây tỷ lệ sống sót ít hơn 20%. Trong thí nghiệm này, bào tử nấm đƣợc chiếu tia UV gián tiếp thông qua lớp curvet thạch anh đặt trong máy so màu bƣớc sóng 260nm. Mặc dù thời gian chiếu xạ rất dài nhƣng tác động gây chết của tia UV lên bào tử nấm không nhiều (chiếu 40 phút tỷ lệ sống 46.15%). Từ đây có thể suy ra ảnh hƣởng của tia UV lên hệ gen của nấm khi chiếu xạ gián tiếp rất ít. Nguyên nhân có thể là do sự cản trở bức xạ của lớp curvet thạch anh. Khi đột biến đƣợc thực hiện trên máy UV-VIS có thể thay đổi đƣợc bƣớc sóng chiếu xạ, do đó có thể khảo sát ảnh hƣởng của các bƣớc sóng khác nhau lên bào tử nấm khi chiếu xạ. Các chủng xử lý đột biến bằng tia UV (T1, T2) sản xuất lƣợng enzyme cao hơn chủng gốc không đáng kể. Nhƣ vậy phƣơng pháp xử lý bằng tia UV chƣa đạt hiệu quả. Để đạt kết quả cao cần khảo sát thêm ở các bƣớc sóng khác hoặc sàng lọc chủng đột biến rộng hơn, hay thay đổi phƣơng pháp chiếu xạ (chiếu trực tiếp tia UV lên bào tử nấm).
Microwave với tần số 2450MHZ không có khả năng phá vỡ các liên kết của phân tử DNA [19]. Tuy nhiên Katita và cộng sự (1995) chỉ ra rằng microwave có thể làm gãy các mảnh DNA của virus (bacteriophages PL-1), điều không quan sát thấy khi làm thí nghiệm chỉ với tác động của nhiệt độ đối với virus ở cùng nhiệt độ với lò vi sóng (trích dẫn bởi Neiva Braun) [19]. Trong thí nghiệm xử lý đột biến bằng microwave (2.3.1.2), bào tử nấm chịu tác động của cả nhiệt độ và vi sóng, chƣa khẳng định đƣợc tác động gây chết lên bào tử nấm do riêng nhiệt độ, vi sóng hay do cả hai nhân tố này. Cần có nhiều nghiên cứu hơn về phƣơng pháp xử lý đột biến bằng microwave:
o Xét riêng ảnh hƣởng của vi sóng (loại bỏ tác nhân nhiệt độ) bằng cách đặt đĩa petri chứa dịch huyền phù bào tử lên hũ đá và đặt vào lò vi sóng.
Chƣơng 4: Bàn luận và kiến nghị
o Xét riêng ảnh hƣởng của nhiệt độ (cùng nhiệt độ và thời gian chiếu so với lò vi sóng).
o Có thể kết hợp hai phƣơng pháp xử lý đột biến bằng microwave và tia UV.
Phƣơng pháp nuôi cấy trong thí nghiệm là phƣơng pháp nuôi cấy theo chu kỳ. Sự phát triển và sinh trƣởng của sinh vật trong hệ kín đó tuân theo quy luật nhất định. Nấm mốc khi đƣợc cấy vào môi trƣờng không phải ngay lập tức chúng tiết ra enzyme. Chúng tồn tại theo nguyên tắc cơ bản của vi sinh vật là tiết kiệm năng lƣợng tối đa. Nghĩa là khi vào môi trƣờng chúng sử dụng ngay những chất dễ sử dụng nhất nhƣ các loại đƣờng đơn và khoáng chất có sẵn, đến khi nguồn dinh dƣỡng đó cạn dần không đủ cung cấp cho việc tăng trƣởng của nấm mốc, thì chúng phải tăng cƣờng tổng hợp các loại enzyme để phân giải các loại cơ chất phức tạp khác có trong môi trƣờng phục vụ cho quá trình tăng trƣởng của chúng. Giai đoạn đầu của quá trình phát triển là pha lag. Giai đoạn này đƣợc tính từ lúc bắt đầu nuôi cấy đến lúc bắt đầu thấy sự sinh trƣởng và phát triển nhanh. Ở giai đoạn này vi sinh vật chƣa tiến hành sinh sản mà chỉ xảy ra quá trình thích nghi với môi trƣờng nuôi cấy. Giai đoạn thứ hai là pha log, pha này đƣợc biểu thị rõ nét bởi tốc độ sinh sản của vi sinh vật đạt cực đại. Tế bào vừa sinh sản mạnh vừa tăng sinh khối. Trong pha này chất dinh dƣỡng giảm đi rất nhanh do sự đồng hóa chúng bởi vi sinh vật diễn ra rất mạnh. Ở giai đoạn này vi sinh vật tiến hành tổng hợp enzyme với số lƣợng và chất lƣợng cao, vì thế nếu mục đích của quá trình nuôi cấy là thu nhận các chất có hoạt tính sinh học hoặc tế bào có khả năng hoạt động mạnh, ngƣời ta thƣờng kết thúc quá trình ở cuối giai đoạn này Nhƣ vậy lƣợng enzyme tăng dần thể hiện qua hoạt tính của nó. Tuy nhiên không phải thời gian càng dài hoạt tính càng tăng mà chúng chỉ tăng cho đến khi quần thể đạt trạng thái ổn định, sau đó hoạt tính lại giảm đi đáng kể (đồ thị 4.4). Hoạt tính enzyme giảm ở pha tử vong do lƣợng tế bào chết nhiều.
Nhìn chung hoạt tính CMCase của Trichoderma reesei khi nuôi cấy trên môi trƣờng bán rắn cao hơn khi nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng. Do điều kiện dinh dƣỡng trên môi trƣờng bán rắn tốt hơn và khả năng phát triển của nấm mốc trên môi trƣờng bán rắn tốt hơn. Khi nuôi cấy nấm mốc môi trƣờng bán rắn chúng ta thƣờng dùng
Chƣơng 4: Bàn luận và kiến nghị
những vật liệu không đồng nhất có hàm lƣợng chất hữu cơ cao. Môi trƣờng bán rắn thƣờng đƣợc làm ẩm tới 60%. Nếu độ ẩm cao hơn môi trƣờng vi khuẩn sẽ phát triển gây tạp nhiễm, khó thông khí dẫn đến nấm mốc kém phát triển. Nếu độ ẩm thấp hơn, môi trƣờng khô nhanh, nấm dễ sinh bào tử và giảm hoạt tính enzyme tạo thành. Muốn vậy phải tạo độ ẩm thích hợp cho môi trƣờng nuôi cấy nấm mốc. Cần khảo sát thêm nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng phát triển và sinh tổng hợp enzyme cellulase của Trichoderma reesei sau khi xử lý đột biến: thành phần môi trƣờng, nồng độ dinh dƣỡng, nhiệt độ, pH, độ ẩm để tìm ra điều kiện tối ƣu cho sản xuất enzyme cellulase.
Theo Trần Thanh Phong và cộng sự (2007) [4] nghiên cứu thu nhận cellulase
Trichoderma reesei VTT-D-80133 sinh trƣởng trên môi trƣờng cám rắn, cơ chất bã mía kết hợp cám mì, tỷ lệ bã mía: cám mì là 7:3, 8 lần nồng độ dinh dƣỡng, độ ẩm 60%, thời gian 7 ngày là tối ƣu cho Trichoderma reesei VTT-D-80133 sinh trƣởng trên môi trƣờng bán rắn. Hoạt tính CMCase 280.64 UI/g. So sánh với Trichoderma reesei T3 sinh trƣởng trên môi trƣờng cám, trấu, thời gian nuôi cấy 3 ngày thu đƣợc hoạt tính CMCase cao nhất thì hoạt tính CMCase của Trichoderma reesei VTT-D- 80133 cao hơn gấp 17.32 lần. Tuy nhiên sự so sánh này là không chính xác do hai chủng đột biến nuôi cấy ở hai môi trƣờng khác nhau. Nếu có điều kiện nên so sánh hai chủng đột biến trong cùng điều kiện nuôi cấy để chọn ra chủng có hoạt tính CMCase cao hơn.
Chủng T3 có hoạt tính enzyme cao hơn hẳn chủng đối chứng. Có thể nói vi sóng đã tác động đến hệ gen sản xuất enzyme cellulase. Nếu có điều kiện cần trích ly các đoạn DNA của chủng đột biến, đem giải trình tự gen để khẳng định chủng T3 là
Trichoderma reesei và xác định các đột biến cụ thể trên các gen sản xuất enzyme cellulase.
Hiện nay trên thế giới phƣơng pháp gây đột biến để chọn lọc các chủng vi sinh vật có hoạt tính cao đang ngày trở nên phổ biến và thu đƣợc nhiều kết quả cao. Theo nghiên cứu của Xing-hua Li và cộng sự [13], sau khi xử lý đột biến Trichoderma reesei bởi vi sóng và tia cực tím, 7 chủng đột biến đƣợc lựa chọn (M-B1 – MB7) và hoạt tính CMCase của chúng đƣợc phân tích. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng có một số đột biến trong gen endoglucanase I (EG I) của chủng đột biến M-B1, M-B2, M-B3, M-B5,
Chƣơng 4: Bàn luận và kiến nghị
nhƣng không thay đổi ở M-B7. Có thể giả thuyết rằng một số biến đổi amino trong EG I có thể là nguyên nhân làm tăng hiệu quả sản xuất cellulase. Kết quả hoạt tính CMCase của 7 chủng đột biến qua 9 thế hệ là ổn định. Chủng T3 thu đƣợc cũng có hoạt tính ổn định qua 9 thế hệ.
Một nghiên cứu khác của N.J.Gadgil và cộng sự [12] nghiên cứu trên giống đột biến Trichoderma reesei QM9414, xử lý đột biến bằng phƣơng pháp kết hợp tia cực tím và natri nitrite. Kết quả hoạt tính enzyme và sự thủy phân cỏ khô tiền xử lý bằng kiềm của chủng đột biến cao hơn chủng Trichoderma reesei QM9414 là 2 lần.
Nhƣ vậy sự sản xuất enzyme cellulase từ chủng Trichoderma reesei sau khi xử lý đột biến còn phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố: cách bảo quản giống sau xử lý đột biến, môi trƣờng nuôi cấy…Để thu đƣợc hiệu quả sản xuất cellulase cao, yếu tố quan trọng nhất là phải có giống tốt, sau đó chọn phƣơng pháp xử lý đột biến hiệu quả, sàng lọc chủng đột biến và nuôi cấy chúng lên môi trƣờng thích hợp.
Chƣơng 5: Kết luận
CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN
1. Phƣơng pháp xử lý đột biến bằng tác nhân vật lý để nâng cao khả năng sản xuất cellulase của nấm mốc: xử lý đột biến bằng tia UV, và xử lý đột biến bằng vi sóng. Xử lý đột biến bằng vi sóng: đã tạo đƣợc chủng đột biến T3, có hoạt tính CMCase cao hơn chủng gốc khoảng 80 lần. Liều lƣợng chiếu xạ bằng microwave: năng lƣợng tối đa 1600 W, tần số 2450 MHZ, thời gian chiếu xạ 30s.
2. Chủng đột biến T3 thu đƣợc có tính ổn định (khảo sát hoạt tính CMCase qua 9 đời hoạt tính vẫn ổn định).
3. Hoạt tính enzyme CMCase của Trichoderma reesei thu đƣợc cao nhất vào ngày thứ 3.
4. Sinh khối chủng đột biến thu đƣợc cao nhất vào ngày thứ 6.
5. Hoạt tính CMCase thu đƣợc khi nuôi trên môi trƣờng bán rắn cao hơn trong môi trƣờng lỏng. Thời gian phát triển tối ƣu: hoạt tính enzyme cao nhất ở ngày thứ 3.
Tài liệu tham khảo
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lê Doãn Diên. 2005. Hóa sinh công nghiệp. NXB Khoa Học và kỹ thuật Hà Nội 2. Nguyễn Đức Lƣợng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết. 2003. Thí nghiệm
công nghệ sinh học tập 2. NXB ĐH Quốc gia
3. Phạm Thành Hổ. 2003. Di truyền học. NXB Giáo dục
4. Trần Thanh Phong, Hoàng Quốc Khánh, Võ Thị Hạnh, Lê Bích Phƣợng, Nguyễn Duy Long, Lê Tuấn Hƣng, Trƣơng Thị Hồng Vân. 2007. Thu nhận enzyme cellulase cuả Trichoderma reesei trên môi trường bán rắn. Tạp chí phát triển KH&CN tập 10, số 07
5. Aftab Ahamed, Patrick Vermette. 2008. Culture-based strategies to enhance cellulase enzyme production from Trichoderma reesei RUT-C30 in bioreactor culture conditions.Biochemical Engineering Journal, 40, 399–407
6. Ainsworth and Bisby.1995. Dictionary of the Fungi
7. David S. HIBBETT and al. 2007. A higher-level phylogenetic classification of the Fungi. Mycological Research, III, pp. 509 – 547
8. Edward A Bayer and al. 1998. Cellulose, cellulases and cellulosomes. Current Opinion in Structural Biology, 8, pp. 548 – 557
9. Gary J. Samuels. 9-2005. Trichoderma: Systematic, the Sexual State, and Ecology. United States Department of Agriculture Agricultural Research Service Systematic Botany and Mycology Laboratory 304, B-011A Beltsville, MD 20705
10.Henri Durand, Marc Clanet Enzyme Microb. 1988. Genetic improvement of Trichoderma reesei for large scale cellulase production. Technol. vol. 10, June 341
11.Ilan Levy and Oded Shoseyov. 2002. Cellulose-binding domains Biotechnological applications. Biotechnology Advances, 20, pp 191–213
12.Jim E. Pitts a, Jaana M. Uusitalo b, Dimitris Mantafounis Philip G. Nugent, Dominic D. Quinn, Poonsook Orprayoon. 1993. Expression and
Tài liệu tham khảo
characterisation of chymosin pH optima mutants produced in Trichoderma reesei. Journal of Biotechnology, 28: 69-83
13.Jost Weber and F.A.Agblevor. 2005. Microbubble fermentation of Trichoderma reesei for cellulase production. Process Biochemistry, volume 40, issue 2, pages 669 – 976 (19)
14.Kubicek C.P., Bissett J., Druzhinina I., Kullnig-Gradinger C.M., Szakacs G. 2003. Genetic and metabolic diversity of Trichoderma: a case study on South East Asian isolates. Fungal Genet Biol, 38:310-319
15.Long Hao, Wang Tianhong*, Zhang Yingkuan. 2000. Isolation of Trichoderma reesei PyrG negative Mutant by UV mutagenesis and its application in transformation1. Natural Science Research Foundation
16.M. J. Bailey and K. M. H, Nevalainen. 1981. Induction, isolation and testing of stable Trichoderma reesei mutants with improved production of solubilizing