Trong đó, khả năng làm giảm của Met là ít nhất (0,084 HP/ml), sau đó là proline (0,080 HP/ml), Ala (0,072 HP/ml), ornithine và arginine (0,064 HP/ml). Công bố
của D.J. Fairbain và cộng sự cho kết quả ngược lại khi tác giả này nghiên cứu sự ảnh hưởng của amino acid lên khả năng sinh protease của Pseudomonase Fluorescens.
2.2.3. Thu nhận và tách chiết các enzyme ngoại bào của Bacillus subtilis subtilis
Chúng ta đều biết rằng để nuôi cấy vi sinh vật và thu nhận enzyme thì có 2 phương pháp: phương pháp nuôi cấy chìm và phương pháp nuôi cấy bề mặt. Ngày nay bằng phương pháp cố định tế bào người ta cũng có thể sinh tổng hợp
được enzyme. Tuy nhiên phương pháp này còn tồn tại nhiều nhược điểm và đòi hỏi công nghệ, thiết bị hiện đại. Các chế phẩm enzyme trong môi trường nuôi cấy thu được ở các phương pháp nói trên còn chứa rất nhiều tạp chất. Nồng độ
enzyme ở trong môi trường nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt khoảng 0,5 - 1%, còn trong môi trường nuôi cấy bằng phương pháp chìm thì tốt hơn, khoảng 0,01%... Thông thường công nghệ tách chiết enzyme từ chế phẩm nuôi cấy chìm hay nuôi cấy bề mặt phải bao gồm các thao tác chủ yếu sau đây: tách các thành phần của môi trường nuôi cấy và sinh khối để nhận được dịch nuôi cấy cô đặc công nghiệp này làm khô và kết tủa enzyme.
Tùy từng lĩnh vực đòi hỏi độ tinh khiết của enzyme mà đặt ra nhu cầu thu nhận enzyme sao cho kinh tế nhất. Ngày nay thường tồn tại hai loại chế phẩm enzyme. Đó là chế phẩm enzyme kỹ thuật và chế phẩm enzyme có độ tinh khiết cao hơn. Chế phẩm enzyme kỹ thuật là chế phẩm đã được tách tạp chất, nhưng ngoài enzyme chủ yếu còn có enzyme khác và protid không có hoạt tính sinh học (nồng độ enzyme khoảng 15 - 20%). Chế phẩm enzyme có độ tinh khiết cao thì ngoài enzyme các chất khác chiếm tỉ lệ không đáng kể. Chế phẩm enzyme kỹ
thuật có thể là dịch cô đặc có nồng độ chất khô 35 - 50% hoặc dạng bột có hàm lượng chất khô khoảng 90%.
2.2.3.1. Thu nhận và tách chiết enzyme α-amylase của Bacillus subtilis
Trong một số ngành công nghiệp nhiều khi đòi hỏi phải có những chế
phẩm có độ tinh khiết cao. Trong thập kỷ 70 của thế kỷ này đã xuất hiện lĩnh vực khác nhau sử dụng các chế phẩm enzyme tinh khiết. Trong quá trình sinh tổng hợp amylase đồng thời cũng xảy ra quá trình sinh tổng hợp protease. Trong trường hợp cần loại bỏ protease ra khỏi chế phẩm amylase người ta cho amylase hấp phụ lên tinh bột, công trình này đã được nêu trong chế phẩm Patent của Mỹ. Trong Patent người ta cũng đã nêu lên việc ứng dụng calci acetate với tỷ lệ từ 2 - 10% (W/V) vì calci acetate đã góp phần hoạt hóa enzyme. Sau đó bổ sung dung môi hữu cơ với nồng độ khoảng từ 0,6 - 1,0 Vdung môi/Vban đầu khi đó amylase bị
kết tủa khi bổ sung dung môi. Theo Molodova (1966) để loại bỏ protease ra khỏi
α-amylase của nấm mốc Aspergillus và Rhizopus sử dụng hạt trao đổi anion, có thể sử dụng nhựa phenolformadehyde, polystiren và các dẫn xuất của cellulose… Người ta đã thu nhận được trên 90% α-amylase. Quá trình thu nhận và làm sạch như sau:
• Chế phẩm enzyme thô thu được sau lên men phải xử lý sơ bộ bằng các phương pháp hóa học nhưđiều chỉnh pH, thêm các chất ổn định 0,1% CaCl2 so với dịch lên men để tạo kết tủa dẫn đến lắng cặn hoạt hóa enzyme và lọc để
loại bỏ tạp chất. Việc này làm mất hoạt tính của enzyme khoảng 2%. Quá trình lọc bỏ tạp chất cũng gặp những khó khăn vì sinh khối tế bào lớn bịt kín các lỗ loc khiến tốc độ lọc chậm dần và thời gian lọc dài dẫn đến tổn thất enzyme rất lớn, cho nên khi lọc người ta còn bổ sung bột trợ lọc, hoặc lọc bằng màng hoặc sử
dụng máy li tâm có tốc độ cao 5000 - 6000 vòng/phút, 96 - 97% sinh khối được tách. Bổ sung các chất trợ lọc như: diatomit của Nhật, filtroperlit của Liên Xô (cũ).
• Sau khi có chế phẩm enzyme khá sạch ở dạng lỏng người ta tiến hành cô đặc. Thông thường người ta hay cô chân không ở nhiệt độ thấp 28 – 30oC để tránh hiện tượng bất hoạt enzyme đây là giai đoạn rất thuận lợi đối với các chế phẩm nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt vì chế phẩm này có nồng độ
chất khô cao hơn so với chế phẩm enzyme nuôi cấy bằng phương pháp chìm. Trong trường hợp thực hiện cô đặc chế phẩm enzyme nuôi cấy bằng phương
pháp chìm thường hay dẫn đến một số biến đổi hóa học, bất lợi cho hoạt động của enzyme làm ảnh hưởng đến tính bền vững của enzyme. Trong vấn đề này Vexelov (1970) đã có nhiều thành tựu, ông cô đặc enzyme bằng phương pháp
đóng băng nhiều lần.
• Ngày nay với thành tựu của công nghệ màng siêu lọc, phương pháp cô đặc dịch lên men đã được thực hiện đơn giản hơn, hiệu quả hơn. Để ứng dụng
được phương pháp này có hiệu quả người ta làm sạch enzyme, chọn nguyên liệu và kích thước màng sao cho phù hợp. Phương pháp này không những chỉ cô đặc enzyme mà còn làm cho chế phẩm sạch hơn, hoạt tính của enzyme bị giảm không
đáng kể trong quá trình lọc.
• Sau khi có được chế phẩm enzyme cô đặc người ta tiến hành sấy phun để thu enzyme khô ở nhiệt độ 120 - 130oC rồi giảm nhiệt độ xuống khoảng 60 - 65oC. Trước khi sấy phun có thể thêm các chất như NaCl nồng độ 200 mg/l hoặc CaSO4, MgSO4 nồng độ 30 - 60 mg/l. Trong quá trình sấy phun hoạt tính enzyme giảm khoảng 10%. Đây hiện là một phương pháp hữu hiệu nhất để sản xuất chế phẩm enzyme kỹ thuật. Tuy nhiên để sấy phun có hiệu quả thì việc xử lý chế phẩm trước sấy phun là việc quan trọng. Độ ẩm của chế phẩm thu được là yếu tố quyết định tác dụng và độ bền vững của enzyme. Chế phẩm thu được có thể bảo quản được 2 năm, sấy phun đơn giản hơn và hạ giá thành sản phẩm.
• Để thu nhận được chế phẩm có độ tinh khiết cao người ta có thể
tiến hành như sau: kết tủa bằng dung môi hữu cơ như aceton, ethanol, muối trung tính để tách enzyme ra khỏi dung dịch, sau đó tách α-amylase ra khỏi hỗn hợp enzyme đã được kết tủa bằng màng siêu lọc, hoặc phương pháp hấp phụ enzyme trên tinh bột. Sắc ký trao đổi ion hoặc dùng phương pháp đẳng điện, rồi kết tinh và sấy khô. Kvesitadze (1984) đã đưa ra bảng quá trình làm sạch và kết tinh α- amylase của Bacillus subtilis như sau:
− Lọc chế phẩm
− Hấp phụ tinh bột
− Muối tách M/30 Na2HPO4
− Tẩy màu trên nhựa Đayrut A2
− Hòa tan kết tủa trong calci acetate M/500
− Thêm aceton ở 00C đến 60% bão hòa
− Hòa tan kết tủa trong calci acetate 0,01M
− Chỉnh pH đến 6,0
− Bảo quản trong lạnh
− Kết tinh
• Tuy nhiên, theo các nghiên cứu gần đây, quá trình kết tủa enzyme lại dùng cồn 96%. Theo Nguyễn Thanh Thủy (2007) khi khảo sát tỷ lệ tủa enzyme α-amylase bằng cồn 96% và tủa bằng (NH4)2SO4đã cho kết quả như sau:
Bảng 2.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ cồn 96% lên khả năng tủa α-amylase
Tỷ lệ enzyme/cồn 96% Protein (mg/100ml chế phẩm tươi) Hiệu suất thu hồi protein (%) Hoạt tính (UI/100ml chế phẩm tươi) Hiệu suất thu hồi hoạt tính (%) 1:1 10,462 ± 0,232 10,78 4366,90 ± 190,003 8,698 1:2 15,963 ± 0,568 16,45 44056,08 ± 80,497 87,751 1:3 21,756 ± 0,232 22,42 45607,75 ± 185,067 90,842 1:4 23,127 ± 0,154 23,83 44284,27 ± 109,698 88,206 1:5 23,696 ± 0,154 24,42 43219,40 ± 270,422 86,085 (trích Nguyễn Thanh Thủy, 2007) − Theo bảng 2.6 thì ở tỷ lệ 1:1, nồng độ cồn thấp chỉ tủa được một lượng nhỏ protein (α-amylase) nên hoạt tính α-amylase thấp. Nhưng ở tỷ lệ
4:1 và 5:1, tuy lượng protein thu nhận được cao hơn, song hoạt tính thấp hơn tỷ
lệ 3:1 là do ở hai tỷ lệ trên nồng độ cồn quá cao đã làm protein bị biến tính nên hoạt tính α-amylase giảm.
Bảng 2.7. Ảnh hưởng của (NH4)2SO4 lên khả năng tủa α-amylase Độ bão hòa (%) Protein (mg/100ml chế phẩm tươi) Hiệu suất thu hồi protein (%) Hoạt tính (UI/100ml chế phẩm tươi) Hiệu suất thu hồi hoạt tính (%) 50 14,805 ± 0,118 15,02 31835,132 ± 205,852 61,73 55 15,846 ± 0,101 16,08 36916,077 ± 73,132 71,58 60 16,683 ± 0,195 16,53 37575,282 ± 20,283 72,86 65 16,683 ± 0,108 16,92 37281,175 ± 123,378 72.29 70 19,037 ± 0,166 19,31 36926,219 ± 126,669 71,60 (trích Nguyễn Thanh Thủy, 2007)
− Theo bảng 2.7 thì tủa bằng (NH4)2SO4 ở 60% độ bão hòa, α- amylase có hoạt tính cao nhất. Ởđộ bão hòa 70%, hoạt tính α-amylase giảm, do nồng độ muối quá cao làm biến tính protein.
− Từ các kết quả trên, tác giảđã kết luận kết tủa bằng cồn 96% ở
tỷ lệ enzyme/cồn 1:3 hoạt tính của α-amylase thu hồi được cao hơn khi kết tủa bằng (NH4)2SO4.
Như vậy, quá trình tách và làm sạch enzyme là một quá trình phức tạp, đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, hóa chất tinh khiết và rất tốn kém. Người ta đã đề nghị
một số ngành sử dụng enzyme nếu không cần tinh khiết thì có thể sử dụng enzyme thô như công nghệ thuộc da và sản xuất rượu bia… Ngày nay trên thị
trường tồn tại khá nhiều chế phẩm enzyme. Trong ngành công nghiệp sản xuất bia người ta đã sử dụng khá nhiều loại enzyme kỹ thuật. Hãng Novo - Nordish của Đan Mạch đã đưa vào thị trường Việt Nam một loại chế phẩm enzyme cho khá nhiều ngành công nghiệp trong đó có ngành công nghệp sản xuất bia.
2.2.3.2. Thu nhận và tách chiết enzyme protease của Bacillus subtilis
a) Thu nhận enzyme protease của Bacillus subtilis
• Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được dịch enzyme protease thô. Để đảm bảo cho dịch enzyme protease thô không bị mất hoạt tính nhanh người ta thường sấy khô dịch bằng máy sấy chân không. Độẩm cần đạt được sau quá trình sấy kết thúc là nhỏ hơn 10%. Đểđảm bảo hoạt tính enzyme không thay
đổi người ta thường sấy ở nhiệt độ 38 - 40oC.
• Tùy theo mục đích sử dụng ta có thể dùng chế phẩm thô không qua quá trình tinh sạch. Trong những trường hợp cần thiết phải tiến hành làm sạch enzyme. Để sản xuất enzyme tinh khiết người phải tiến hành như sau:
− Toàn bộ khối lượng enzyme protease thô được nghiền nhỏ. Mục
đích của quá trình nghiền là vừa phá vỡ thành tế bào, vừa làm nhỏ các thành phần của chế phẩm thô. Khi thành tế bào được phá vỡ, các enzyme nội bào dễ dàng thoát khỏi tế bào. Phần lớn enzyme protease ngoại bào khi được tổng hợp và thoát ra khỏi tế bào ngay lập tức thấm vào thành phần môi trường. Khi nghiền nhỏ, enzyme thoát ra khỏi các thành phần này dễ dàng hơn. Khi nghiền người ta thường sử dụng các chất trợ nghiền như cát thạch anh và bột thủy tinh. Đây là những chất vô cơ không tham gia vào phản ứng và tăng khả năng ma sát, trước khi sử dụng cát thạch anh và bột thủy tinh phải được rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ
lớn hơn 100oC để loại bỏ nước và tiêu diệt vi sinh vật. b) Tách chiết enzyme protease của Bacillus subtilis
• Sau khi nghiền mịn, người ta cho nước vào để trích ly enzyme protease. Các loại enzyme thủy phân có khả năng tan trong nước nên dùng nước như một dung môi hòa tan. Cứ một phần chế phẩm enzyme thô, cho 4 - 5 phần nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch.
• Quá trình kết tủa enzyme nhờ những tác nhân gây tủa như: cồn 96%, sulphate ammon, muối (NH4)2SO4… Khi tiến hành tủa, phải làm lạnh cả
dung dịch enzyme thô và cả những tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính của enzyme. Khi đổ chất kết tủa enzyme vào dung dịch enzyme thô phải tiến hành từ từđể tránh hiện tượng biến tính.
• Trong quá trình kết tủa người ta dùng cồn hoặc sulphate ammon với liều lượng như sau: cứ một phần dung dịch enzyme thô cho 2 đến 2,5 lần cồn hoặc sulphate ammon.
• Khi cho chất kết tủa vào dung dịch enzyme thô, tiến hành khuấy nhẹ, sau đó để yên trong điều kiện nhiệt độ lạnh (thường là từ 4 - 7oC) theo thời gian, các enzyme sẽ được kết tủa và lắng xuống đáy, tiến hành gạn và lọc thu nhận tủa (độẩm lớn hơn 70% trọng lượng).
• Ở trạng thái này enzyme rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước. Để
dễ bảo quản, sấy kết tủa enzyme protease ở 40oC cho đến khi độ ẩm cuối cùng
đạt 5 - 8% trọng lượng (thiết bị sấy thường dùng là máy sấy phun sương).
• Trong nhiều trường hợp chế phẩm enzyme protease ở dạng kết tủa vẫn hoàn toàn chưa sạch về mặt hóa học vì trong đó còn chứa một số enzyme ngoài enzyme khác lẫn vào.
CHƯƠNG 3: ỨNG DỤNG ENZYME
NGOẠI BÀO CỦA BACILLUS SUBTILIS
3.1. Ứng dụng trong thực phẩm
3.1.1. Trong công nghệ sản xuất bia
Bia là một loại giải khát mát bổ, có nồng độ cồn thấp, có độ mịn xốp và có hương vị đặc trưng. Hương liệu của bia là do các chất chiết từ nguyên liệu, cồn và CO2 và sản phẩm lên men khác nhau tạo nên. Đặc biệt, CO2 bão hòa trong bia có tác dụng giải khát rất tốt. Nhờ những ưu điểm này mà bia được sản xuất khắp nơi trên toàn thế giới.
Hiện nay trên thế giới có khoảng 25 nước sản xuất bia với sản lượng trên 1 tỷ lít mỗi năm. Trong đó có Mỹ, Cộng Hòa Liên Bang (CHLB) Đức, Trung Quốc mỗi năm sản xuất trên 10 tỷ lít, sản lượng tính theo đầu người năm 1984 ở Đan Mạch là 182 lít/năm, ở CHLB Đức, Hà Lan 146 lít/năm.
Ở Việt Nam, mấy năm gần đây, sản lượng bia đã tăng lên nhanh chóng. Nếu 10 năm trước, nước ta chỉ có 2 nhà máy bia ở Hà Nội và Sài Gòn thì nay ước tính có hàng trăm nhà máy, xí nghiệp và phân xưởng sản xuất bia lớn, nhỏ có quy mô công nghiệp. Năm 1994, theo thống kê thì bình quân đầu người là 5 lít/năm.
Từ xa xưa trong công nghệ sản xuất bia ở hầu khắp các nước trên thế giới
đều dùng malt, nhưng khác với sản xuất rượu, malt chủ yếu là tác nhân đường hóa thì trong sản xuất bia malt vừa là tác nhân đường hóa, vừa là nguyên liệu sản xuất.
Sản xuất bia theo sơđồ công nghệ thông thường các hệ enzyme được tạo ra trong quá trình nảy mầm cần thiết để xử lý nguyên liệu bột chuyển các chất chiết sang trạng thái hòa tan ở giai đoạn nấu.
Các enzyme tạo ra trong quá trình nảy mầm và có ý nghĩa quan trọng nhất trong công nghệ sản xuất bia là enzyme amylase dịch hóa và đường hóa tinh bột. Enzyme protease phân giải protein của đại mạch đến các polysaccharide không
phải là tinh bột, hòa tan màng nội nhũ hạt ngũ cốc, làm cho các enzyme amylase và protease dễ dàng tác dụng đến cơ chất tương ứng.
Mỗi quá trình kể trên cần tiến hành đến mức độ xác định để ổn định việc lọc dịch đường hóa, lên men dịch đường, làm trong và lọc bia; cũng như tạo ra những tính chấ,t mùi vị và lý hóa xác định cho bia.
Những enzyme có nguồn khác nhau dùng thay thế enzyme của malt cần phù hợp với enzyme của malt về đặc tính tác dụng và phải trội hơn về hoạt lực, do đó cho phép giảm quy mô sản xuất chế phẩm enzyme, so với quy mô sản xuất malt.
Ở Liên Xô (cũ) những công trình nghiên cứu có hệ thống vềứng dụng chế
phẩm enzyme từ vi sinh vật với mục đích thay thế một phần đáng kể malt bằng
đại mạch chưa nảy mầm được tiến hành sớm hơn ở các nước khác. Người ta có thể thay thế 86 - 100% malt bằng đại mạch chưa nảy mầm. Có sử dụng hỗn hợp enzyme α-amylase của Asp. oryzae và Bacillus subtilis.
Trên thế giới có rất nhiều nước quan tâm đến việc sản xuất bia từ đại