a) Đặc điểm và cơ chế tác dụng của enzyme protease của Bacillus subtilis
• Protease của Bacillus subtilis bao gồm protease kiềm và protease trung tính.
• Protease trung tính của của Bacillus subtilis thủy phân liên kết peptide tạo thành nhóm carboxyl của Ala, serine hay His và nhóm amin của valine (Val), leucine (Leu) hay phenylalanine (Phe). Tính đặc hiệu của protease kiềm của Bacillus subtilis lại khác, nó thủy phân hàng loạt các peptide. Protein
được thủy phân ở mức độ nhiều hơn so với protease trung tính.
• Protease trung tính có trung tâm hoạt động lớn hơn vào khoảng 21Aº, có thể phân biệt thành sáu phần dưới trung tâm hoạt động, mỗi phần dưới trung tâm hoạt động tương ứng với một gốc amino acid trong phân tử cơ chất.
• Protease trung tính thường không ổn định, các ion Ca2+, Na+ và Cl- có tác dụng làm tăng tính ổn định của các enzyme này, khoảng pH tối thích thường hẹp. Ởđiều kiện nhiệt độ 37oC, hoạt tính của protease là 100% thì ở nhiệt
độ 50oC, sau 30 phút, hoạt tính của enzyme giảm xuống còn 80%. Sau 30 phút, ở
nhiệt độ 60oC, hoạt tính chỉ còn 20% và ở 70oC thì chỉ sau 10 phút, enzyme đã bị
mất hoạt tính hoàn toàn.
• Về vai trò của gốc Tyr trong trung tâm hoạt động của các protease trung tính cũng được Tsuru và cộng sự (1970) xác nhận. Các tác giả cho rằng, có thể có 3 gốc Tyr cùng với nguyên tử Zn tham gia trong trung tâm hoạt động của
Bacillus subtilis.
• Năm 1970, Kerry T.Yasunnobu và Jame Mc Cohn đã nghiên cứu và tách chiết protease trung tính từ môi trường nuôi Bacillus subtilis theo phương pháp nuôi bán rắn và nhận thấy đây là một protease kim loại có ion Ca2+ trong trung tâm hoạt động, có pH tối ưu từ 6,5 - 7,5; nhiệt độ tối ưu là 57oC. Protease này bịức chế bởi các ion Cu2+, Ni2+, Hg2+, Pb2+, Cd2+ và Fe2+ còn khi có mặt ion Ca2+ enzyme này có thể bền trong khoảng pH từ 5,5 - 10.
• Nedkov (1966) đã xác định được trung tâm hoạt động của Sutilisin, một enzyme protease kiềm từBacillus subtilis là: Asp, Gly, Thr, Ser, Met và Ala.
• Chất kìm hãm và chất hoạt hóa: hoạt tính của một số enzyme protease còn phụ thuộc vào sự có mặt của các ion kim loại và một số hợp chất khác. Một số những chất đó có tác dụng làm tăng hoạt tính, còn một số khác lại có tác dụng kìm hãm hoạt tính của các enzyme. Protease của Bacillus subtilis bị
mất hoạt tính bởi hợp chất tạo phức và nồng độ urea cao. Ngoài ra nó bị kìm hãm bởi EDTA.
• Protease kiềm của Bacillus subtilis bị kìm hãm bởi thuốc thử thiol ví dụ như p-chloromercuribenzoate (PCMB), đây cũng là điểm đặc trưng đối với tất cả các protease kiềm (Govind và cộng sự, 1981).
• Cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân của protease kiềm thông qua hai bước chính (Barrett, 1994):
− Acyl hóa: hình thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm -OH của serine với nguyên tử carbon trong nhóm carboxyl của phân tử cơ chất nhờ có hỗ
trợ của nhóm imidazole từ histidine.
− Khử acyl hóa: phức hệ acyl - enzyme bị thủy phân bởi phân tử
H2O theo chiều ngược lại của bước acyl hóa. Trong đó, nhóm imidazole chuyển proton của gốc -OH từ serine cho nhóm amin để tái sinh lại enzyme.
• Subtilisin (EC.3.4.21.62) là một protease kiềm. Phân tử subtilisin
được tạo nên bởi một chuỗi polypeptide. Subtilisin có một domain bảo thủ với 7 nếp gấp βđược bao bọc bởi 9 vòng xoắn α. Trung tâm hoạt động của enzyme này là bộ ba truyền thống của serine protease theo thứ tự là Asp-His-Ser. Theo phân tích trình tự DNA mã hóa subtilisin người ta thấy subtilisin được tổng hợp dưới dạng một tiền enzyme, đoạn peptide sau khi được tổng hợp vẫn chưa thực hiện
được chức năng của nó và để trở thành dạng hoạt động nó phải trải qua một quá trình cải biến, cắt bỏ phần pre-pro-peptide. Cấu trúc của tiền enzyme gồm: một
đoạn peptide được gọi là prepeptide ở đầu N, có vai trò làm tín hiệu để tiết tiền enzyme ngoại bào. Cuối đoạn peptide này chứa trình tự amino acid tín hiệu cho sự phân cắt của peptidase là Ala-Gln-Ala-Ala. Nối giữa đoạn peptide tín hiệu này với đoạn peptide của subtilisin trưởng thành là propeptide. Propeptide đóng vai
trò như một enzyme xúc tác quá trình cuộn xoắn tạo cấu trúc có hoạt tính cho subtilisin trưởng thành. Việc cuộn xoắn không gian là bước đầu tiên để tạo thành subtilisin có hoạt tính. Quá trình này phụ thuộc vào propeptide và đòi hỏi phải có ion Ca2+để làm bền. Subtilisin là nhóm enzyme với 2 đại diện là subtilisin BPN' và subtilisin Carlberg. Trong đó, Bacillus subtilis có khả năng sinh subtilisin BPN'.
• Subtilisin BPN' và subtilisin Carlberg khác nhau 58 amino acid nhưng chúng hoạt động tối ưu ở cùng một điều kiện là 60°C và pH 10 (Smith và cộng sự, 1968; Phadarate và cộng sự, 1997; Siezen và Leunissen, 1997). Khác với subtilisin Carlberg độ bền của subtilisin BPN' lại phụ thuộc vào Ca2+. Subtilisin BPN' còn là một enzyme ngoại bào nên có thể dễ dàng thu hồi và tinh sạch hơn các enzyme nội bào, do vậy việc ứng dụng enzyme này ngày một phổ
biến.
• Subtilisin BPN' là một serine protease ngoại bào và là một lớp enzyme đại diện lớn nhất của serine protease có cấu trúc đặc trưng là α/β/α và trung tâm hoạt động gồm Ser221, His64, Asp32. Cấu trúc không gian ba chiều của chúng bền vững trong khoảng pH rộng và ngay cả khi có mặt của dung môi hữu cơ (Siezen và Leunissen, 1997; Thomas và cộng sự, 1999).
• Subtilisin BPN' là một pre-pro-enzyme (Wells và cộng sự, 1983). Trình tự pre- là một chuỗi gồm 30 amino acid có chức năng như một chuỗi peptide tín hiệu trong quá trình tiết subtilisin ra môi trường bên ngoài. Trình tự
pro- gồm 77 amino acid được nối với subtilisin chỉđến khi quá trình gấp nếp kết thúc và sau đó chúng tự động cắt bỏ khỏi phân tử subtilisin trưởng thành. Chính vì thế chuỗi peptide gồm 77 amino acid này được ví như một “foldase” xúc tác cho quá trình gấp nếp của phân tử enzyme. Phân tử subtilisin trưởng thành gồm 275 amino acid và có khối lượng phân tử là 27,5 kDa (Ikemura and Inouye, 1988; Ohta and Inouye, 1990).
• Đường có tác dụng kích thích enzyme protease ngược lại acid có tác dụng ức chế enzyme protease, acid tartric ức chế mạnh nhất.
• Chất chát với nồng độ 0,02% có tác dụng kìm hãm sự hoạt động của enzyme protease. Rượu với nồng độ 8% về thể tích không làm giảm hoạt tính enzyme protease.
b) Sinh tổng hợp enzyme protease của Bacillus subtilis
• Quá trình tổng hợp enzyme nói chung cũng như tổng hợp protease
ở vi sinh vật chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau như: độẩm, nhiệt độ, độ
pH, độ thông khí và thành phần môi trường…
− Ảnh hưởng của nhiệt độ: nhiệt độ có ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi khuẩn cũng như tính chất của enzyme được tổng hợp, mỗi loài có nhiệt độ thích hợp khác nhau. Tuy nhiên, đa số các vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme đều không bền với nhiệt độ và bị kìm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp. Nhiệt độ tối ưu của
Bacillus subtilis sinh tổng hợp enzyme protease là 37oC.
− Ảnh hưởng của pH môi trường: khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt, pH môi trường ít ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật, hơn nữa pH môi trường hầu như không thay đổi trong quá trình phát triển của vi sinh vật. Ngược lại, trong phương pháp nuôi cấy chìm, pH môi trường ảnh hưởng rất lớn đến đến sự tích lũy protease trong môi trường của vi sinh vật. Điều này thể hiện rất rõ ở các loài thuộc chi Bacillus. pH môi trường có thể thay đổi sau khi khử trùng hoặc trong quá trình phát triển của vi sinh vật. pH tối ưu cho sự phát triển và sinh tổng hợp enzyme protease của Bacillus subtilis là 7,0 - 8,0.
+ Trong quá trình nuôi cấy, tùy theo thành phần môi trường và các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất ở vi sinh vật, pH của môi trường có thể chuyển dần về phía acid hoặc kiềm. Tuy nhiên, người ta nhận thấy một số vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy có khả năng tự điều chỉnh pH môi trường. Điều
đó được giải thích là do chúng có khả năng tạo ra các enzyme chuyển hóa các acid hữu cơđược tạo ra do phân giải các carbohydrate thành các sản phẩm trung hòa. Bởi vậy chúng đã duy trì được pH thích hợp trong suốt quá trình phát triển của chúng. Chính vì thế khi nuôi cấy các chủng vi khuẩn Bacillus trong đó có
Bacillus subtilis để sinh tổng hợp enzyme người ta ít khi bổ sung các chất trung hòa vì pH thay đổi không đáng kể (trích Đỗ Thị Giang, 1988).
+ Theo Đỗ Thị Bích Thủy và Trần Thị Xô (2004), khi nghiên cứu ảnh hưởng của pH ban đầu và nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng sinh enzyme protease của Bacillus subtilis trong môi trường nuôi cấy thì kết quả cho thấy rằng
Bacillus subtilis có khả năng sinh protease cao nhất khi nuôi cấy ở nhiệt độ 350C và pH ban đầu thích hợp nhất là 6, hoạt tính đạt được trong điều kiện nuôi cấy này là 0,560 HP/ml. Trong khi đó khi nuôi cấy với pH ban đầu là 10 ở các mức nhiệt độ 25oC, 55oC, 60oC chủng này hầu như không sinh enzyme.
− Ảnh hưởng của độ thông khí: độ thông khí trong môi trường có
ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh tổng hợp protease. Tuy nhiên, ảnh hưởng này có khác nhau tùy theo loài vi sinh vật. Trong một số trường hợp:
+ Thiếu oxy, tuy có kìm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật nhưng lại làm tăng quá trình tổng hợp protease. Sự hiếu khí mạnh lại kìm hãm sinh tổng hợp protease.
+ Lượng oxy thích hợp cho quá trình tổng hợp protease của các vi sinh vật có khác nhau (Crivova, 1973; Aravina và cộng sự, 1976).
− Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy: thời gian hoạt động của protease vi khuẩn phụ thuộc độ bền hoạt tính của protease. Thông thường hoạt tính của protease có thể giữ được trong khoảng từ 60 - 82 giờ tuy nhiên hoạt tính sẽ giảm dần theo thời gian. Hoạt động của protease chỉ mạnh trong khoảng thời gian xác định tùy loài vi khuẩn. Protease của Bacillus subtilis sinh tổng hợp hoạt
động tốt nhất trong khoảng thời gian 46 - 68 giờ.
− Ảnh hưởng của nguồn carbon: nguồn carbon thường dùng để
nuôi cấy vi sinh vật là các glucid: monosaccharide, disaccharide và cả
polysaccharide (tinh bột), đặc tính tác dụng của nguồn carbon phụ thuộc vào bản chất hóa học của chúng và đặc tính sinh lý của vi sinh vật. Nguồn carbon tự
nhiên thường dùng trong môi trường nuôi cấy là bột mì, bột đậu tương, cám và nước chiết của chúng. Ở vi khuẩn Bacillus subtilis, quá trình tổng hợp protease xảy ra khá mạnh khi nguồn carbon là tinh bột với nồng độ khoảng 8%. Nếu giảm
nồng độ tinh bột xuống còn 2% thì sẽ làm giảm một phần hoạt tính trong quá trình phân giải protein của dịch môi nuôi cấy.
+ Theo Đỗ Thị Bích Thủy và Trần Thị Xô (2004), khi nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn carbon lên khả năng sinh protease của Bacillus subtilis, các tác giảđã bổ sung các nguồn carbon khác nhau như tinh bột hòa tan, maltose, lactose, saccharose và dextrose với nồng độ 0,5% vào môi trường cơ
bản thịt-peptone, đồng thời khảo sát trên mẫu đối chứng và tiến hành nuôi cấy thu enzyme thô, xác định hoạt tính enzyme. Họ nhận thấy rằng tinh bột hòa tan là nguồn carbon kích thích Bacillus subtilis sinh tổng hợp protease tốt nhất, hoạt tính của enzyme thô (0,156 HP/ml) lớn hơn so với mẫu đối chứng (0,096 HP/ml) là 1,6 lần. Điều này có lẽ là do trong môi trường có tinh bột đã kích thích chủng này sinh amylase. Chính amylase này (thực chất là nguồn protein) là chất cảm
ứng sinh protease… Ngược lại, với kết quả này, khi khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon lên khả năng sinh protease của một chủng Bacillus sp. thì S.Mehrotra và cộng sự (1998) đã công bố rằng tinh bột không có vai trò kích thích. Trong khi đó, lactose, saccharose, dextrose kìm hãm khả năng sinh protease của chủng này (hoạt tính chỉ đạt được 0,016 HP/ml). Đối với dextrose, nhiều công bố cho rằng dextrose kìm hãm khả năng sinh protease của Bacillus
sp., những công trình khác lại cho là kích thích. S.Mehrotra và cộng sự (1998) cũng đã công bố rằng lactose, saccharose, maltose có tác dụng kìm hãm khả năng sinh protease của Bacillus sp.
+ Tuy nhiên một số nghiên cứu gần đây lại dùng nguồn carbon khác. Theo Ngô Thị Thanh Nhàn (2008), khi nghiên cứu về nguồn carbon của chủng Bacillus subtilis 61 với những nguồn carbon khác nhau như: trisodium citrate, casein, glucose và acid citric thì chỉ có trisodium citrate và casein thì khả
năng tổng hợp protease của chủng này cao hơn đáng kể so với các nguồn carbon còn lại. Điều đó cho thấy trisodium citrate và casein là những nguồn carbon thích hợp để tổng hợp protease. Trong đó, trisodium citrate cho kết quả cao nhất (0,034 UI/ml). Kết quả này cũng giống như kết quả nghiên cứu của Meire và Wellingta (2004) trisodium citrate là nguồn carbon tốt cho việc tổng hợp protease.
Bảng 2.4. Hoạt tính protease của chủng Bacillus subtilis 61 khi thay đổi các nguồn carbon trong môi trường nuôi cấy
Nguồn carbon Hoạt tính protease (UI/ml) Trisodium citrate 0,034 Casein 0,020 Tinh bột 0,001 Acid citric 0,000 Glucose 0,001 (trích Ngô Thị Thanh Nhàn, 2008)
− Ảnh hưởng của nguồn nitrogen: các chất có thể dùng làm nguồn nitrogen trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật có thể là các chất hữu cơ
hoặc các muối vô cơ. Nhiều vi sinh vật còn có thể sử dụng nitrogen của HNO3. + Nguồn nitrogen hữu cơ thường có ảnh hưởng tốt đến quá trình sinh tổng hợp protease vì chúng có vai trò như chất cảm ứng của quá trình này. Các nguồn nitrogen thường dùng là: các loại bột khác nhau, nước chiết cám, nấm men tự phân, pepton và protein. Trong các nguyên liệu này đều có hàm lượng amino acid tương đối thấp.
+ Khi sử dụng phối hợp nguồn nitrogen hữu cơ và vô cơ sẽ
làm tăng đáng kể quá trình sinh tổng hợp protease (Âu Thị Bích Phượng, 2006). Theo Ngô Thị Thanh Nhàn (2008) khi nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitrogen lên khả năng sinh tổng hợp protease của chủng Bacillus subtilis 61 tác giả đã dùng các nguồn nitrogen khác nhau như: NH4NO3, KNO3, (NH4)2SO4, NH4Cl cao nấm men, cao thịt và phối hợp giữa nguồn nitrogen hữu cơ pepton với các nguồn nitrogen vô cơ khác. Kết quả là sự phối hợp giữa nguồn nitrogen hữu cơ pepton và KNO3đạt giá trị hoạt tính cao nhất là 0,038 UI/ml so với các nguồn khác.
Bảng 2.5. Hoạt tính protease của chủng Bacillus subtilis 61 khi phối hợp các nguồn nitrogen khác nhau trong môi trường nuôi cấy
Nguồn nitrogen Hoạt tính protease (UI/ml)
KNO3 0,038 (NH4)2SO4 0,026 NH4Cl 0,021 NH4NO3 0,019 Cao thịt 0,010 Cao nấm men 0,008 (trích Ngô Thị Thanh Nhàn, 2008)
− Ảnh hưởng của khoáng: phosphore và sulphur có ảnh hưởng
đáng kểđến quá trình sinh tổng hợp protease. Nói chung, phosphore vô cơ có ảnh hưởng xấu đến quá trình tổng hợp protease. Tuy nhiên, KH2PO4 thường có ảnh hưởng tốt đến quá trình tổng hợp enzyme thủy phân nhờ tính chất đệm của nó.
− Ảnh hưởng của các nguyên tố vi lượng: các yếu tố vi lượng như
NaCl và vitamin… cũng có ảnh hưởng đến lượng protease trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật. Các muối chloride, nitrate, amonium có ảnh hưởng xấu đến quá trình tổng hợp protease.
− Ảnh hưởng của amino acid: các amino acid có ảnh hưởng rõ rệt tới sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Gly, Ala, Met và Leu có tác dụng làm tăng hoạt lực protease của chủng đột biến A. oryzae 251 - 90 đến 6- 9% và nguyên chủng A. oryzae 132 - 63 tới 7- 24%. Nhiều amino acid có tác dụng ức chế sinh tổng hợp enzyme là Val, Glu và isoleucine trong đó Val ức chế tổng hợp enzyme ở Bacillus megaterium 60%. Còn đối với Bacillus subtilis các amino acid
ức chế trong quá trình này là Gly, Met, Glu, Ala, Leu…
+ Theo Đỗ Thị Bích Thủy và Trần Thị Xô (2004), khi nghiên cứu ảnh hưởng của các amino acid lên khả năng sinh enzyme protease của vi