a) Đặc điểm của enzyme α-amylase
Ngoài những đặc điểm chung đã nêu (ở chương 1), enzyme α-amylase của
• Enzyme amylase thường gặp khi nuôi cấy vi sinh vật gồm: α- amylase, β-amylase, glucoamylase (amyloglucosidase hay γ-amylase). Trong đó,
Bacillus subtilis có thể tổng hợp nên α-amylase.
• Dưới tác dụng của α-amylase tinh bột sẽ mất khả năng tạo màu với iodine và độ nhớt giảm rất nhanh, α-amylase thường bền nhiệt hơn các amylase khác. Khi có mặt ion Ca2+ cấu trúc của α-amylase sẽ bền vững và ổn định hơn, kém bền trong môi trường acid. α-amylase của Bacillus subtilis có thể chịu được nhiệt độ cao và ổn định hơn các loài nấm mốc vì trong phân tử enzyme có chứa 4 ion Ca2+.
• α-amylase của Bacillus subtilis không có các liên kết disulfide và disunithidine. Hoạt tính của chúng có liên quan mật thiết với sự có mặt của ion Ca2+ trong phân tử vì ion này được dùng để duy trì hoạt động của enzyme, từđó nó có vai trò quan trọng trong việc ổn định hoạt tính của enzyme và tăng cường
độ bền của α-amylase trước các tác nhân biến tính và tác dụng phân hủy của protease.
• Theo Huỳnh Minh Thư (2008), khi khảo sát ảnh hưởng của Ca2+ lên hoạt tính của amylase từBacillus subtilis thì kết quả như sau:
Bảng 2.3. Ảnh hưởng của Ca2+ lên hoạt tính của amylase từBacillus subtilis
Nồng độ Ca2+ (%) Hoạt tính α-amylase (UI/ml)
0,1 2880,47
0,15 3371,84
0,2 3001,29 (Huỳnh Minh Thư, 2008)
− Tác giả đã nhận xét như sau: tùy vào đặc điểm sinh lý sinh hóa của mỗi loại vi sinh vật nhu cầu Ca2+ sẽ khác nhau. Theo kết quả trên, sau khi hoạt tính amylase đạt cực đại, nếu tăng nồng độ ion Ca2+ thì hoạt tính amylase có xu hướng giảm. Điều này do nồng độ ion Ca2+ đã bão hòa và ức chế quá trình
tổng hợp enzyme của vi khuẩn. Kết quả này phù hợp với dẫn liệu của Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (2003), hàm lượng ion Ca2+ thích hợp cho vi khuẩn là 0,01 - 0,03 g/l. Nhưng theo kết quả nghiên cứu của Lê Văn Việt (2007) thì hoạt tính amylase cao nhất đạt được ở nồng độ ion Ca2+ là 0,125%. Sự khác biệt này là do sự khác nhau về nguồn nguyên liệu, nguồn nước sử dụng cũng như sự khác nhau về nhu cầu Ca2+ của chính các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis nghiên cứu.
• α-amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột bị
thương tích, còn α-amylase của Bacillus subtilis lại có khả năng phân hủy những hạt tinh bột nguyên lẫn hồ tinh bột. α-amylase của Bacillus subtilis phân giải tinh bột nguyên nhanh hơn 2 - 2,5 lần so với α-amylase của nấm mốc. α-amylase của
Bacillus subtilis khi lên men rượu, từ tinh bột nấu chín chuyển hóa thành đường nhanh hơn từ tinh bột sống. Sau 1 ngày lên men hàm lượng CO2 thoát ra trong trường hợp nấu chín tinh bột là 9,7g trong khi để đạt được hàm lượng này, khi không nấu chín tinh bột cần thời gian là 4 ngày.
• Các chủng vi khuẩn chẳng hạn như Bacillus subtilis thường không có độc tố lại tạo ra α-amylase có hoạt tính cao hơn hẳn các chủng nấm mốc. Hiệu suất thu hồi α-amylase của Bacillus subtilis cũng cao hơn khoảng 5 - 10 lần so với các chủng nấm mốc.
b) Cơ chế và điều kiện hoạt động
• Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen:
− Tinh bột: là nhóm carbohydrate ở thực vật, có chủ yếu trong các loại củ như khoai lang, khoai tây, khoai mì, ngũ cốc, các loại hạt… và có công thức tổng quát là (C6H12O6)n. Tinh bột từ mọi nguồn khác nhau đều có cấu tạo từ amylase và amylopectin (Meyer, 1940). Các loại tinh bột đều có 20 - 30% amylase và 70 - 80% amylopectin. Ở thực vật, tinh bột là chất dự trữ năng lượng quan trọng.
Hình 2.2. Cấu trúc của phân tử amylose và amylopectin
− Glycogen: là một loại carbohydrate dự trữ. Ởđộng vật được dự
trữ trong cơ thể động vật và được cơ thể chuyển hóa để sử dụng từ từ. Amylase có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa glucid ở tế bào động vật, vi sinh vật, glycogen được cấu tạo từ các glucose liên kết với nhau bởi liên kết α-1,4- glycoside ở các vị trí phân nhánh, glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,6- glycoside. Glycogen có số mạch nhiều hơn tinh bột. Phân tử lượng ở trong khoảng 2 - 3.106 Da. Glycogen dễ tan trong nước, nếu ăn quá nhiều carbonhydrate thì cơ thể sẽ chuyển hóa chúng thành chất béo dự trữ. Ởđộng vật và người, glycogen tập trung chủ yếu trong gan.
• Quá trình α-amylase của Bacillus subtilis phân giải tinh bột tương tự như mọi loại α-amylase của các vi sinh vật khác. Có thể tóm tắt như sau:
− Giai đoạn đầu: trong tinh bột, dưới sự xúc tác của α-amylase chỉ một số liên kết trong phân tử bị đứt và độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh tạo thành dextrin có phân tử lượng lớn, người ta gọi đây là giai đoạn dịch hóa hay dextrin hóa.
− Giai đoạn 2: thủy phân các dextrin phân tử lớn vừa được tạo thành. Nhờ đó, tinh bột có thể chuyển thành maltotriose, maltose, glucose và
dextrin phân tử lượng thấp. Tuy nhiên, thông thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp không cho màu với iodine và một ít maltose.
• Theo số liệu của Lifsitx (1967), pH tối ưu cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm α-amylase của Bacillus subtilis nằm trong vùng pH 5,6 - 6,2. Còn theo số liệu của Fenikxova (1969) thì pH tối thích cho hoạt
động dextrin hóa của nó là 6 - 7, bị mất hoạt tính hoàn toàn ở pH = 1 và bị mất hoạt tính một phần ở pH = 8.
• Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác nhau. Theo một số tài liệu đã được công bố, dưới tác dụng của acid độ bền của α-amylase từ các nguồn khác nhau như sau: Aspergillus batatae > Aspergillus usamii > Aspergillus oryzae > Aspergillus awmori > Bacillus subtilis > thóc mầm.
• Khi so sánh độ bền với acid của α-amylase của malt, Bacillus subtilis và một số chủng nấm, Fenikxova (1969) và cộng sựđã xác định rằng, α- amylase của Aspergillus oryzae 3-9-15 và Aspergillus oryzae476-I bền vững hơn so với vi khuẩn Bacillus subtilis và malt. Ở giá trị pH thấp 3,6 ở nhiệt độ 0oC, α- amylase của malt bị bất hoạt hoàn toàn sau 30 phút, và α-amylase của Bacillus subtilis bị bất hoạt tới 50%, trong khi nấm mốc hầu như không bị bất hoạt.
• α-amylase của Bacillus subtilis tác dụng lên tinh bột tạo ra các dextrin có mạch dài khoảng 6 - 8 gốc glucose (gelatin6 (G6), gelatin7 (G7), gelatin8 (G8)). Các dextrin này lại bị phân giải tiếp tục theo sơđồ:
G6 G1 + G5; G7 G1 + G6 hay G2 + G5 (ít) G8 G2 + G6 hay G3 + G5 (ít)
• Khi α-amylase tác dụng vào tinh bột, sản phẩm tạo thành của phản
ứng này bao gồm: dextrin (trong đó chủ yếu là detrin phân tử lượng thấp), maltose và glucose. So với α-amylase của nấm mốc, α-amylase của vi khuẩn có hoạt lực dextrin trội hơn là hoạt lực đường hóa, theo số liệu của Lifsitx và cộng sự, khả năng dextrin hóa của α-amylase từAspergillus oryzae cao hơn khả năng
đường hóa 1,75 lần còn ởBacillus subtilis thì cao hơn 2 lần (Lifsitx và Baznit - senko, 1967).
• Kretovits và Iarovenko (1970) khi nghiên cứu đường hóa tinh bột bằng α-amylase của Bacillus subtilis với các liều lượng khác nhau thấy rằng quá
đường hóa đều kết thúc nhanh sau 36 giờ, sau đó lượng glucid không lên men còn lại không đổi trong suốt 36 giờ còn lại.
• Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-amylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất. Người ta nhận thấy rằng α-amylase của vi khuẩn ít bền vững ởđiều kiện pH thấp nhưng lại khá bền ở nhiệt độ cao so với
α-amylase của nấm sợi. α-amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác động của nhiệt. Nhiệt độ tối ưu của nó là 50oC. Amylase của thóc mầm và malt bền nhiệt hơn và hoạt động tối ưu ở 58 - 60oC, còn α-amylase của Bacillus subtilis thì nhiệt
độ tối ưu có thể đạt từ 70 - 80oC. α-amylase của các chủng vi khuẩn chịu nhiệt thường bền nhiệt hơn α-amylase của các chủng vi sinh vật khác như: α-amylase của Bacillus stearothermophilus 5034 không mất hoạt tính sau 24 giờ nấu ở nhiệt
độ 50oC - 70oC. α-amylase của Bacillus stearothermophilusBS -I thì ở 90oC sau 6 phút thì hoạt tính giảm 17% trong khi đó α-amylase của Bacillus subtilis bị mất hoạt tính hoàn toàn.
• Kvexitazde và cộng sự (1890) đã tiến hành so sánh tính chất đặc trưng của α-amylase giữa 4 chủng vi khuẩn và nấm mốc điển hình. Theo ông, có thể sắp xếp theo khả năng chịu nhiệt của α-amylase từ 4 chủng như sau: Bacillus stearothermophilus > Bacillus subtilis > Aspergillus niger >Aspergillus oryzae
còn khả năng chịu acid thì ngược lại: Aspergillus niger >Aspergillus oryzae > Bacillus subtilis > Bacillus stearothermophilus.
• Ở tây Đức người ta đã tuyển chọn được một chủng Bacillus subtilis
mà amylase của nó không khác gì amylase của vi khuẩn thông thường vềđặc tính tác dụng lên tinh bột song lại có độ bền nhiệt như amylase của nấm sợi (Srisler, Unlig, 1972). Tính chất của α-amylase từ chủng bền nhiệt này cũng đặc trưng cho Bacillus subtilis: có pH tối ưu 6,0; bị bất hoạt hoàn toàn ở pH = 4 và bị mất hoạt tính 50% ở pH = 8.
c) Sinh tổng hợp α-amylase của Bacillus subtilis
• Amylase của vi khuẩn Bacillus subtilis là một enzyme cảm ứng với cơ chất là tinh bột hay glycogen. Khi trong môi trường có mặt những cơ chất này
thì Bacillus subtilis sẽ tổng hợp nên enzyme amylase để thủy phân các cơ chất về
các dạng hợp chất có phân tử lượng thấp có thểđi qua màng tế bào.
• Khi nuôi cấy vi sinh vật tạo amylase có hai quá trình liên quan mật thiết với nhau: quá trình tổng hợp sinh khối vi sinh vật và quá trình tích tụ
enzyme trong tế bào hay ngoài môi trường. Hai quá trình này không phải bao giờ
cũng trùng khớp với nhau về thời gian, nhất là trong phương pháp nuôi cấy chìm.
• Amylase của Bacillus subtilis được tạo thành ở vi khuẩn trong giai
đoạn đã hoặc đang kết thúc quá trình sinh trưởng. Cả trong môi trường nuôi cấy lẫn trong bản thân tế bào vi khuẩn “trẻ” đều không tìm thấy amylase. Amylase ngoại bào được tổng hợp ở tế bào đang chuyển sang thời kỳ tự phân (autolysis).
• Nhiều tác giả cho rằng quá trình tổng hợp enzyme xảy ra trên màng tế bào (Nomura, 1958), và người ta lập luận rằng ở gần màng tế bào tập trung enzyme phân hủy, nó ở trạng thái không hoạt động khi amylase chưa được tạo thành. Khi bắt đầu tổng hợp amylase, enzyme phân hủy trở nên hoạt động và làm biến đổi cấu trúc màng tế bào tới độ cho phép các phân tử amylase đứt ra ngoài môi trường. Song, thật ra, amylase ngoại bào được tổng hợp liên tục và độc lập với amylase nội bào. Trong các tế bào được phân hủy sơ bộ bằng lysozyme chỉ
chứa một lượng amylase rất nhỏ, không thể đáp ứng được amylase hoạt động mạnh mẽ như vậy.
• Các yếu tốảnh hưởng của thành phần môi trường:
− Ảnh hưởng của thành phần môi trường:
+ Ảnh hưởng của nguồn cacbon dinh dưỡng: nồng độ tinh bột tối ưu cho nuôi cấy chìm là 0,5 - 0,7%. Để có hoạt lực α-amylase cao cần 6% tinh bột. Tuy nhiên, khi sinh tổng hợp α-amylase của Bacillus subtilis thì việc thay tinh bột bằng maltose đã làm khả năng sinh tổng hợp enzyme tăng 50%. Nhưng Srivastava và cộng sự (1981), lại cho rằng isomaltose và panose mới là cơ
chất cảm ứng tốt nhất đối với sinh tổng hợp α-amylase của Bacillus subtilis. Nhiều nghiên cứu đã đi đến khẳng định là các loại đường có phân tử nhỏ dễ hấp thụ, không thúc đẩy mà kìm hãm quá trình sinh tổng hợp. Chất kìm hãm điển hình là glucose, người ta gọi là “hiệu ứng glucose”, cơ chế kìm hãm sinh tổng hợp α-amylase của glucose là do dư thừa các sản phẩm trao đổi chất từ glucose,
có trong tế bào vi sinh vật. Các chất này được tích tụ nhanh, do vậy nhu cầu sản sinh các enzyme tạo thành các chất trên là không cần thiết nữa.
+ Ảnh hưởng của nguồn nitrogen dinh dưỡng: cho nguồn nitrogen nhất định vào môi trường có thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác. Nguồn nitrogen hữu cơ: gelatin, casein, nước chiết ngô.
+ Ảnh hưởng của amino acid: amino acid có ảnh hưởng tốt tới sinh lý của vi sinh vật tạo enzyme amylase do amino acid có thể vừa là nguồn cacbon, vừa là nguồn nitrogen, vừa là nguồn năng lượng; một số amino acid riêng rẽ đóng vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp nhiều amino acid khác và trong quá trình chuyển hóa amin.
+ Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng: các nguyên tố đa lượng và vi lượng có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và tổng hợp các enzyme amylase của vi sinh vật. Mg2+ảnh hưởng đến độ bền của enzyme; phosphore ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh sản của vi sinh vật; Ca2+ cần cho tổng hợp và ổn định
α-amylase của Bacillus subtilis, hoạt động, bảo vệ enzyme khỏi tác dụng của protease; lưu huỳnh kích thích tạo amylase; các ion Zn2+ có trong α-amylase của
Bacillus subtilis là cầu nối liên kết tạo thành dimer có phân tử lượng 48.000 Da; cobal kích thích tổng hợp amylase; Mn2+, Cu2+, Hg+ kìm hãm sinh tổng hợp amylase.
+ Ngoài ra, sự tiết amylase vào canh trường nuôi cấy bị ức chế hoàn toàn bởi các chất kìm hãm trao đổi chất như cyanide, chloramphenicol, streomysin, toluen, NH4Cl, (NH4)2SO4 và Urea được xác định là những chất kìm hãm hoạt động của enzyme α-amylase. Nhưng khi thêm một số chất hoạt động bề mặt (Tween 20, Tween 40, Tween 60 và Tween 80) và Sodium lauryl sulphate nồng độ 0,02% đã cho kết quả tăng 2 - 15% trong việc sản xuất enzyme.
+ Tóm lại, nguồn carbohydrate, nguồn đạm nếu dư thừa sẽ ảnh hưởng không tốt đến khả năng sinh tổng hợp enzyme. Một số amino acid kích thích hoặc kìm hãm không đáng kể với sinh tổng hợp α-amylase (acgine, asparagine, proline…) và một số khác ức chế hoàn toàn. Việc sử dụng nguồn nitrogen, nguồn carbohydrate nào là việc làm không thể thiếu trong quá trình
nghiên cứu. Xác định tỉ lệ thích hợp giữa các nguồn nguyên liệu bổ sung rất cần thiết. Ngày nay nhờ tối ưu hóa thành phần môi trường đã làm cho quá trình nghiên cứu nhanh chóng thu được kết quả hữu hiệu, hoạt độ enzyme tăng rất nhiều. Do áp dụng phương pháp này mà Macximova và cộng sự (1968) đã làm tăng hoạt độ α-amylase của Bacillus diastaticus lên hai lần, Dzavakhia và cộng sự (1978) đã làm tăng lên 40% hoạt độα-amylase thu nhận từBacillus subtilis.
− Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy: hiện nay tồn tại nhiều ý kiến khác nhau về thành phần môi trường nhân giống. Một số tác giả nhận thấy rằng môi trường nhân giống cần phải giàu dinh dưỡng hơn môi trường lên men mới tạo ra được lượng sinh khối nhiều và khỏe cho quá trình sinh tổng hợp enzyme. Khi môi trường nhân giống giàu dinh dưỡng hơn môi trường lên mên thì sinh khối lớn đã ức chế khả năng xâm nhập của vi sinh vật ngoài môi trường vào và hoạt độ enzyme tăng rất mạnh. Nhưng một số nhà nghiên cứu khác cho rằng môi trường nhân giống và môi trường lên men phải là một. Theo Đỗ Thị Giang (1988) cho rằng việc sử dụng môi trường như nhau sẽ rút ngắn được giai đoạn tiềm phát và chu kỳ sản xuất cũng được rút ngắn.
+ Ảnh hưởng của pH môi trường: pH ban đầu của môi trường có ảnh hưởng không nhỏ tới sự tạo thành amylase. Việc lựa chọn giá trị pH ban
đầu căn cứ vào đặc tính của chủng vi sinh vật. pH môi trường để nuôi Bacillus subtilis nhằm thu α-amylase thích hợp nhất là 6,8 - 7,5.