3.1.1 Tổng quan – phân loại
Các chất chống oxy hóa là các hợp chất có khả năng làm chậm lại, ngăn cản hoặc đảo ngược quá trình oxy hóa các hợp chất có trong tế bào của cơ thể . Ngoài ra chúng còn sàng lọc các gốc tự do như gốc alkyl lipid, gốc peroxy lipid, cô lập kim loại
chuyển tiếp, dập tắt các oxy singlet 1O2 và vô hoạt các chất làm tăng độ nhạy quang
học cho dầu .
Dựa trên nguyên tắc hoạt động, các chất chống oxy hóa được phân thành hai loại: các chất chống oxy hóa bậc một và các chất chống oxy hóa bậc hai. Các chất chống oxy hóa bậc một khử hoặc kết hợp với các gốc tự do do đó kìm hãm pha khởi phát hoặc bẻ gãy dây chuyền phản ứng của quá trình oxy hóa. Các chất chống oxy hóa bậc hai kìm hãm sự tạo thành các gốc tự do (hấp thụ các tia cực tím; tạo phức với các kim loại kích hoạt sự tạo gốc tự do như Cu, Fe; vô hoạt oxi đơn)
Bảng 3 : tính tan của 1 số chất chống oxy hóa và hàm hượng của chúng trong huyết tương ( serum ) và gan (liver )
Hệ thống các chất chống oxy hóa của cơ thể người được cung cấp bởi hai nguồn: bên trong và bên ngoài. Các chất chống oxy hóa bên trong bao gồm các protein (ferritine, transferrine, albumine, protein sốc nhiệt) và các enzyme chống oxy hóa (superoxide dismutase, glutathion peroxydase, catalase). Các chất chống oxy hóa bên ngoài là các cấu tử nhỏ được đưa vào cơ thể qua con đường ăn uống bao gồm vitamin E, vitamin C, các carotenoid và các hợp chất phenolic . Bên cạnh đó, một số chất chống oxy hóa có nguồn gốc thực vật như flavonoid đã được ứng dụng rộng rãi trong những năm gần đây, đặc biệt là ubiquitous . Nhóm các polyphenol có hoạt tính chống oxy hóa bao gồm vitamin A, vitamin E, coenzyme Q, vitamin C, flavonoid… Các chất này có nhiều trong rau quả , chúng được coi là các chất chống oxy hóa tự nhiên . Việc sử dụng nhiều rau quả là con đường đơn giản và hữu hiệu nhất để tăng cường hoạt động của hệ thống chống oxy hóa và ngăn ngừa các bệnh có nguồn gốc stress oxy hóa .
Chất chống oxy hóa có thể nhường điện tử cho các gốc tự do để chuyển chúng thành các chất không gốc tự do bền. Các chất chống oxy hóa theo kiểu này chính là
Hình 10 : Sự bền hóa cộng hưởng của một chất chống oxy hóa
các monohydroxyl hoặc polyhydroxyl phenolic. Bất kỳ chất nào có điện thế khử nhỏ hơn điện thế khử của gốc tự do đều có thể nhường điện tử cho gốc tự do nếu phản ứng động học thuận lợi. Điện thế khử chuẩn 1 điện tử của alkoxy, peroxyl và gốc alkyl của các acid béo không bão hòa lần lượt là 1600, 1000 và 600 mV. Điện thế chuẩn của các chất chống oxy hóa thường khoảng 500mV hoặc thấp hơn. Vì thế, các chất chống oxy hóa sẽ phản ứng với gốc peroxyl trước khi các gốc peroxyl này kịp phản ứng với các phân tử lipid khác để hình thành nên gốc tự do. Bất kỳ gốc chống oxy hóa nào được tạo thành do sự kết hợp giữa chất chống oxy hóa và lipid đều có năng lượng thấp hơn peroxyl do cấu trúc cộng hưởng của nó.
Các chất tạo phức với kim loại như acid phosphoric, acid citric, acid ascorbic và EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) làm giảm sự oxy hóa dầu theo cùng một cách thức như nhau. Chúng có thể chuyển sắt, đồng thành phức không hòa tan hoặc gây cản trở không gian đối với sự hình thành các phức kim loại-hydroperoxide. Hiệu quả chống oxy hóa của acid citric tăng khi hàm lượng của nó tăng và thường cần nhiều hơn 150ppm acid citric để vô hoạt 1ppm kim loại.
Một vài chất chống oxy hóa dập tắt các 1O2 hoặc chất nhạy ánh sáng. 1O2
được dập tắt theo cả cơ chế vật lý và hóa học. Theo cơ chế vật lý, 1O2 bị chuyển
thành 3O2 bởi sự vận chuyển năng lượng hay điện tích. Theo cơ chế hóa học, các
chất chống oxy hóa phản ứng với 1O2 và tạo thành các chất chất oxy hóa bị oxy hóa.
3.1.2 Tocopherol ( vitamin E )
Tocopherol là chất chống oxy hóa quan trọng trong dầu. Dầu hạt cải, dầu hướng dương và dầu ngũ cốc có chứa hàm lượng cao tocopherol, còn dầu cọ thì chứa ít hơn. Tuy nhiên trong dầu cọ có chứa -, -, -tocotrienol. Tocopherol cạnh tranh với các acid béo không bão hòa và với các gốc peroxyl . Gốc peroxyl phản ứng với
tocopherol nhanh hơn nhiều(v=104 -109 M-1s-1) so với lipid (v=10 -60M-1s-1). Một phân tử tocopherol có thể bảo vệ 103-108 phân tử acid béo không bão hòa khi chỉ số peroxide thấp. Tocopherol có thể chuyển một điện tử ở vị trí hydroxy thứ 6 ở vòng chroman của nó sang gốc peroxy và dập tắt gốc peroxy này. Tocopherol(T) có điện
thế khử khoảng 500 mV nhường điện tử cho gốc peroxy(ROO•)(có điện thế khử là
1000 mV) và hình thành nên hydroperoxide(ROOH) và gốc tocopheroxy(T•). Gốc
tocopheroxy bền hơn gốc peroxy do cấu trúc cộng hưởng của nó. Vì thế, sự oxy hóa dầu giảm xuống trong bước phát triển mạch của quá trình tự ôi hóa dầu. Gốc tocophroxy có thể phản ứng với nhau hay với các hợp chất khác tùy thuộc vào tốc độ oxy hóa dầu. Khi tốc độ oxy hóa dầu thấp, tocopheroxy phản ứng với nhau để hình thành tocopheryl quinone. Khi tốc độ oxy hóa dầu cao, tocopheroxy phản ứng với gốc peroxy để hình thành nên phức tocopherol-peroxy(T-OOR). Phức này có thể bị thủy phân thành tocopheryl quinone và hydroperoxide.
T + ROO•− → T + ROOH
T• + T• → T + Tocopheryl quinone
T• + ROO• → [T − OOR] → Tocopheryl quinone + ROOH
Hiệu quả chống oxy hóa của tocopherol phụ thược vào dạng đồng phân và nồng độ sử dụng. Khả năng dập tắt gốc tự do cao nhất ở δ-tocopherol, tiếp theo là -, -, and -tocopherol. Hàm lượng tocopherol cần thiết để chống ôi hóa dầu tùy thuộc vào độ bền oxy hóa của chúng. Độ bền oxy hóa của tocopherol càng thấp thì hàm lượng tocopherol cần dùng càng thấp. -tocopherol có độ bền thấp nhất trong số có đồng phân tocopherol, cần dùng với nồng độ 100 ppm thì thể hiện hoạt tính chống oxy hóa cao nhất của nó. Trong khi đó, - và δ-tocopherol có độ bền oxy hóa cao hơn, cần nồng độ 250 và 500 ppm để thể hiện hoạt tính chống oxy hóa cao nhất.
Tocopherol, đặc biệt là -tocopherol, đóng vai trò như chất hỗ trợ sự oxy hóa khi nồng độ của chúng trong dầu cao. Khi nồng độ peroxy rất thấp, các gốc tocopheroxy lôi kéo điện tử từ lipid để tạo thành tocopherol và gốc alkyl lipid. Sự hình thành alkyl lipid sẽ làm tăng tốc độ ôi hóa dầu. Khả năng thúc đẩy sự oxy hóa thể hiện cao nhất ở -tocopherol, tiếp theo là - và δ-tocopherol. Giá trị ngưỡng để -tocopherol thể hiện như chất hỗ trợ oxy hóa trong dầu nành là 60-70 ppm. Khi trong dầu càng ít –tocopherol thì giá trị ngưỡng này càng thấp. Khả năng gây oxy hóa của –tocopherol giảm khi nhiệt độ tăng, ngay cả ở nồng độ cao. Acid ascorbic có thể làm giảm các gốc tocopheroxy theo sơ đồ sau:
T• + RH → T + R•
R• + O2 → ROO•
Hình 11 : Vitamin E tác dụng với gốc tự do ·OH
Ngoài ra, tocopherol còn làm giảm sự oxy hóa dầu do ánh sáng theo cơ chế dập tắt 1O2. Khả năng dập tắt 1O2 tùy thuộc vào hàm lượng và loại tocophetol. Ở nồng độ 1.10-3M, hoạt tính triệt tiêu 1O2 giảm theo thứ tự sau -> ->- tocopherol. Tuy
nhiên, ở nồng độ 4.10-3M thì không có sự khác biệt. Tocopherol có thể hình thành
một phức vận chuyển điện tích ([T+–O2]1) với 1O2 bằng cách cho 1O2 điện tử. Phức [T+–O2]1ở trạng thái đơn bội sẽ thông qua hệ thống vận chuyển nội phân tử sẽ hình thành nên phức ở trạng thái tam bội [T+–O2]3 và sản phẩm chuyển hóa cuối cùng là tocopherol và oxy dạng ít hoạt động hơn 3O2. Quá trình này không liên quan đến các phản ứng hóa học nên quá trình này gọi là dập tắt vật lý:
Hình 12: Sự oxy hóa của oxy đơn bội với -tocopherol
3.1.3 Carotenoid
β-carotene có thể làm giảm sự oxy hóa lipid bằng cách lọc ánh sáng, dập tắt
1O2, vô hoạt chất nhạy ánh sáng và loại bỏ các gốc tự do. Theo Fakourelis, β-
carotene có thể làm giảm sự oxy hóa dầu olive trong điều kiện ánh sáng ở 25o bằng
cách lọc bỏ các các ánh sáng có bước sóng 400 và 500nm. Trong sự hiện diện đồng
thời của chlorophyll, β-carotene làm giảm sự oxy hóa dầu nành bằng cách dập tắt
1O2. Quá trình dập tắt 1O2 xảy ra theo cơ chế vận chuyển năng lượng từ 1O2 sang β- carotene mà không có hình thành các sản phẩm oxy hóa. Các carotenoid ở trạng
thái kích thích này sẽ quay về trang thái năng lượng cơ bản bằng cách giải phóng năng lượng dưới dạng nhiệt theo sơ đồ sau:
1O2 + 1Carotenoid → 3O2 + 3Carotenoid•
3Carotenoid•→ Carotenoid + Heat
Một phân tử β-carotene có thể dập tắt 250-1000 phân tử 1O2 với tốc độ 1,3.1010 M-1s-1. Quá trình dập tắt 1O2 phụ thuộc vào số nối đôi liên hợp của carotenoid. Các carotenoid có ít nhất 9 nối đôi liên hợp như -carotene, lycopene, lutein là những chất dập tắt 1O2 hiệu quả, trong khi đó phytoene, phytofluene, ỉ- carotene thì không có hiệu quả.Khả năng dập tắt 1O2 gia tăng khi số nối đôi liên hợp của carotenoid gia tăng. -carotene và lycopene có khả năng dập tắt 1O2 cao hơn so với β-carotene.
Carotenoid vô hoạt các chất nhạy ánh sáng bằng cách hấp thu năng lượng từ chúng. Các carotenoid hoạt hóa này sẽ quay trở lại trạng thái nền bằng cách phóng thích năng lượng của nó vào trong dầu. Theo Lee(2003), carotenoid có điện thế khử
1electron cao Eo’ =1060mV. Do đó, chúng khó có thể nhường điện tử cho alkyl (Eo’
=600 mV) hoặc gốc peroxy (Eo’ =770-1440 mV) của các acid béo không bão hòa. Tuy
nhiên, β-carotene có thể nhường điện tử cho gốc hydroxy(Eo’ =2310 mV) và hình
thành gốc carotene. Gốc carotene là một loại gốc bền do sự không định vị của các electron không cặp đôi thông qua hệ thống các nối đôi liên hợp. Khi nồng độ oxy thấp, gốc carotene này có thể phản ứng với các gốc khác như gốc peroxy để tạo thành sản phẩm không còn gốc tự do. Cơ chế như sau:
Car + HO• → Car• + H2O Car• + ROO•→ Car-OOR
Gốc peroxy có thể phản ứng với carotene để tạo thành gốc carotene- peroxy(ROO-Car), đặc biệt là khi áp suất riêng phần của oxy cao hơn 150 mmHg. Gốc carotene-peroxy sẽ phản ứng với 3O2 rồi lipid để tạo thành gốc alkyl lipid, trong bước phát triển mạch theo sơ đồ sau:
ROO• + Car → ROO − Car
ROO – Car + 3O2 → ROO − Car − OO•
ROO − Car − OO• + R’H → ROO − Car − OOH + R’•
3.1.4 Các hợp chất phenolic khác
1 số hợp chất phenolic khác trong cũng có hoạt tính chống oxy hóa . Dầu
vừng (IV =109) có độ bền oxy hóa tốt. Tốc độ tự oxy hóa của dầu vừng ở 60oC thấp
hơn so với dầu ngũ cốc, dầu rum và dầu nành. Dầu vừng thu được từ các hạt vừng đã rang có độ bền oxy hóa cao hơn so với dầu thu được từ các hạt vừng chưa rang. Độ bền oxy hóa của dầu vừng có liên quan đến sự hiện diện của lignan và tocopherol. Hợp chất lignan trong dầu vừng bao gồm sesamin, sesamol, sesamolin,
sesaminol, sesamolinol . Sesamin là hợp chất lignan chứa nhiều hơn hết trong dầu vừng chưa rang. Sasamol có hàm lượng thấp trong dầu vừng chưa rang nhưng trong dầu vừng đã rang, hàm lượng cao hơn. Sesamol hình thành bởi phản ứng thủy phân sesamolin suốt trong quá trình tinh luyện dầu. Sesamol được chuyển đổi thành sesamol dimer rồi thành sesamol dimer quinone. Sesamol và sesaminol có hoạt tính chống oxy hóa cao hơn so với sesamin.
Sesamol đóng vai trò như chất chống oxy hóa trong điều kiện ánh sáng cũng như trong tối. Sesamol có hoạt tính chống oxy hóa thấp hơn -tocopherol trong
sự oxy hóa quang học bởi chlorophyll, nhưng hoạt tính chống oxy hóa xấp xỉ δ-
tocopherol ở cùng nồng độ phân tử. Cơ chế chống oxy hóa của sesamol là dập tắt các oxy đơn bội 1O2.
Dầu vừng cũng chứa các phytosterol như campesterol, stigmasterol, -sitosterol, 4,5-avenasterol. Sitosterol vừa đóng vai trò là chất hỗ trợ sự oxy hóa do làm gia tăng độ hòa tan oxy trong dầu, vừa đóng vai trò là chất chống oxy hóa yếu bằng cách cạnh tranh sự oxy hóa với lipid.
Dầu olive rất bền oxy hóa. Các hợp chất phenolic chính trong dầu bao gồm tyrosol (4-hydroxyphenylethanol), hydroxytyrosol (3,4-dihydroxyphenylethanol), hydroxybenzoic acid, oleuropein, caffeic acid, vanillic acid, p-coumaric acid, dẫn xuất của tyrosol và hydroxytyrosol. Các hợp chất phenolic này đóng vai trò như những chất chống oxy hóa trong bước khởi mạch của sự tự oxy hóa bằng cách dập tắt gốc tự do và cô lập kim loại xúc tác. Hydroxutyrosol là chất chống oxy hóa chính trong dầu olive. Các o-diphenol như acid caffeic bị oxy hóa thành quinone và trở nên không hiệu quả trong việc cô lập sắt. Tuy nhiên, hydroxytyrosol, tyrosol, acid vanillic, acid p-coumaric không bị oxy hóa bởi sắt.
3.1.5 flavonoid
Flavonoid (hoặc bioflavonoid) là những hợp chất polyphenol chuyển hóa trung gian của thực vật , phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên . được đặt trưng bởi mạch
carbon C6-C3-C6. Cấu trúc cơ bản của những hợp chất này bao gồm 2 vòng thơm được
liên kết bởi một mạch 3 carbon. Flavanoid bao gồm flavone, flavonol, isoflavone, flavonone và chalcone, trong đó, flavone và flavonol là phổ biến nhất.
Từ Latin flavus nghĩa là màu vàng, màu của flavonoid trong tự nhiên . Tuy nhiên một số flavonoid có màu xanh, tím đỏ và cũng có một số khác lại không có màu. Trong thực vật cũng có một số nhóm hợp chất khác không thuộc flavonoid nhưng lại có màu vàng như carotenoid, anthranoid, xanthon có thể gây nhầm lẫn .
Hơn 4000 loại flavonoid đã được tìm ra , nhiều loại trong số chúng có mặt trong các loại rau quả và nước giải khát ( trà , cà phê , bia , rượu vang , trái cây họ cam chanh , nho , các sản phẩm từ đậu nành ) . flavonoid được chứng minh là có khả năng kháng virus, chống dị ứng, chống viêm và chống ung thư và đặc biệt là chống oxy hóa . Cụ thể , flavonoid thực hiện cơ chế tạo phức với các ion kim loại nên có tác dụng như những chất xúc tác ngăn cản các phản ứng oxy hoá dầu mỡ và duy trì 1 lượng glutathione hợp lý trong tế bào .
Hình 15: Cấu tạo phân tử của một vài flavonoid
Cơ chế chống oxy hóa của flavonoid theo các cách sau: loại bỏ gốc tự do ( các anion superoxide, gốc peroxy và gốc hydroxyl), triệt tiêu oxy đơn bội 1O2, cô lập kim loại và ức chế enzyme lipoxygenase.
Flavonoid có những nhóm hydroxyl đóng vai trò như những chất triệt tiêu gốc tự do. Các nhóm chức hydroxyl trong vòng B là những vị trí ngăn chặn sự oxy hóa cơ bản nhất.
Cũng như trong các hợp chất phenolic khác, vị trí và số lượng các nhóm hydroxy ảnh hưởng đến hoạt tính của flavonoid. Mức độ nhường điện tử tùy thuộc vào hai nhóm hydroxy ở vị trí ortho trên vòng B. Khi có thêm một nhóm –OH ở vị trí 5’ cũng làm tăng hoạt tính chống oxy hóa của flavonoid.
Ví dụ: Myricetin có 3 nhóm –OH nên hoạt động hơn so với quercetin(2 nhóm – OH) và hesperitin(1 nhóm –OH)
−OH ở C3(alglycone) tăng khả năng chống oxy hóa hơn so dạng glycosilate.
Nhóm –OH trên vòng A, ở vị trí 5,7 hoặc 7,8 tăng hoạt tính chống oxy hóa.
Flavonoid có nhóm −OH ở vị trí ortho trên vòng B hoặc có nhóm –OH đều có
thể kết hợp mạnh với các gốc tự do.
Khả năng tạo phức với ion kim loại của flavonoid cần phải có cấu trúc 3’,4’−dihydroxy, quan trọng hơn là C4 quinone cà C3 hoặc C5−OH.
Hình 16: Cơ chế cô lập kim loại của flavonoid