IV. ÁP DỤNG ĐỐI VỚI MỘT SỐ VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM
4.4 Định lượng Enterococci đường ruột trong nước bằng phương pháp màng lọc
pháp màng lọc
Enterococci đường ruột là các vi khuẩn có khả năng phân giải 2,3,5- triphenyltetrazolium chloride tạo thành formazan và thuỷ phân aesculin ở 440 C trên môi trường quy định tại phương pháp này.
Lọc, nuôi cấy và đếm:
Đếm Enterococci đường ruột dựa trên việc lọc một thể tích xác định của mẫu nuớc qua một màng lọc có kích thước lỗ thích hợp (0,45 μm) để giữ lại các vi khuẩn. Màng lọc được đặt vào trong môi trường thạch chọn lọc chứa natri azide (để ngăn chặn sự sinh trưởng và phát triển của các vi khuẩn gram âm) và 2,3,5-triphenyltetrazolium chlorua (một chất nhuộm không màu). Enterococci đường ruột sẽ khử thuốc nhuộm không màu thành focmazan đỏ.
Sau khi nuôi cấy ở 36.0 ± 2.00C/ 44 ± 4 h, đếm tất cả các khuẩn lạc mọc màu đỏ, màu hạt dẻ hoặc màu hồng.
Khẳng định:
Chuyển màng lọc có các khuẩn lạc vào môi trường bile-aesculin-azide agar, ủ ở 44.0 ± 0,50C. Enterococci đường ruột thuỷ phân aesculin trong môi trường trong 2 giờ, sản phẩm cuối cùng là 6,7 - dihidroxycoumarin sẽ kết hợp với ion sắt (III) cho hợp chất màu nâu vàng đến đen và khuếch tán vào môi trường.
Môi trường nuôi cấy:
- Môi trường Slanetz and Bartley - Thạch mật aesculin - azide Thiết bị: - Thiết bị màng lọc - Màng lọc vô trùng với kích thước lỗ 0,45μm. - Tủấm 36.0 ± 2.00C - Tủấm 44.0 ± 0.50C Quy trình tiến hành: Chuẩn bị:
Chuẩn bị mẫu, thiết bị lọc vô trùng và môi trường nuôi cấy. Mẫu nên được phân tích ngay sau khi lấy. Nếu mẫu bảo quản ở nhiệt độ phòng (250C) thì không được bảo quản quá 6 giờ, nếu mẫu bảo quản ở nhiệt độ 5 ± 30C thì không được quá 24 giờ trước khi phân tích.
Lọc và nuôi ủ
Lọc một thể tích nước thích hợp.
Điều chỉnh các dịch pha loãng sao cho các khuẩn lạc có thể mọc tách biệt ra và dễ dàng đếm được.
Sau khi lọc, tháo màng bằng kẹp đã khử trùng và đặt màng lọc lên mặt thạch Slanetz and Bartley. Nuôi các đĩa ở 36.0 ± 2.00C trong 44 giờ ± 4 giờ.
Khẳng định và đếm :
Sau khi nuôi, đếm tất cả các khuẩn lạc có màu nâu đỏ hoặc màu hồng từ trung tâm hoặc toàn bộ khuẩn lạc.
Nếu trên màng có các khuẩn lạc đặc trưng, chuyển màng lọc sang môi trường bile –aesculin-azide agar đã được ủ ấm đến 440 C (không lật ngược màng), ủ ở 44.00 C ± 0.50C trong 2 giờ.
Đọc kết quả ngay. Tất cả các đĩa cho khuẩn lạc có màu từ nâu đến đen, hoặc môi trường bao quanh có màu nâu hay đen được coi là phản ứng dương tính.
Báo cáo kết quả:
Kết quả biểu thị bằng số vi khuẩn Enterococci đường ruột trong một đơn vị thể tích mẫu và được tính theo hướng dẫn trong ISO 8199.
Các chú ý và giới hạn của phương pháp
Bile-aesculin-azide-agar có chứa Natri azide. Do Natri azide có độc tính cao nên chú ý khi thực hiện cần tránh tiếp xúc trực tiếp với hoá chất đó, đặc biệt không được hít các hạt bụi của môi trường trong quá trình pha chế môi trường tổng hợp. Môi trường có chứa azide không nên pha với các axit vô cơ mạnh bởi vì nó có thể tạo ra chất độc HN3. Dung dịch chứa azide cũng có thể hình thành nnên hợp chất gây nổ khi tiếp xúc với các ống dẫn bằng kim loại.
Màng lọc được làm từ cellulose và có đường kính mắt lưới khoảng 47- 50mm.
Màng lọc phải đảm bảo không có tính chất ức chế hoặc kích thích sự phát triển của vi khuẩn, mực in sử dụng để in các mắt lưới trên màng lọc cũng không được ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn. Nếu chưa vô trùng thì chúng cần phải được khử trùng theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Việc sử dụng màng lọc của các hãng khác nhau có thể dẫn đến việc hình thành màu sắc khác nhau của vi khuẩn trên màng.