IV. ÁP DỤNG ĐỐI VỚI MỘT SỐ VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM
4.1Định lượng Fecal Coliform và E Coli bằng phương pháp đếm đĩa
Coliforms chịu nhiệt: là những vi khuẩn sinh trưởng cho khuẩn lạc điển hình trên môi trường thạch Violet Red Bile ở 440C trong 24 giờ. Trong trường hợp nghi ngờ, vi khuẩn được khẳng định bởi sự tạo khí trong môi trường EC broth ở 44 0C trong 24 giờ.
E. coli: là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indol ở 44 0C.
Nguyên tắc:
Cấy một lượng mẫu đã biết trên môi trường rắn không chọn lọc. Sau đó , ủ sơ bộ ở nhiệt độ phòng (20-250C) trong 1-2 giờ, phủ lên một lớp môi trường rắn chọn lọc có chứa Lactose. Các đĩa được ủ ở 440C trong 24h, sau đó đếm những khuẩn lạc điển hình và nghi ngờ cấy những khuẩn lạc đã chọn lên những môi trường khẳng định thích hợp.
Môi trường-thuốc thử -dịch pha loãng:
-Dung dịch Saline Peptone -Thạch Tryptone Soya ( TSA ) -Thạch Violet Red Bile ( VRB ) -Canh Escherichia coli (EC broth) -Canh Tryptone
-Thuốc thử Kovac’s
Chủng chứng:
- Chủng chứng dương: Escherichia coli
- Chủng chứng âm: Salmonellatyphimurium
Thiết bị chính:
- Tủ ấm 44.0 + 0.50C
Quy trình:
Chuẩn bị mẫu.
Đổ đĩa: Cấy 1ml mẫu ở nồng độ thích hợp vào đĩa Petri . Thêm vào 5ml môi trường TSA đã được làm nguội ở 45.00+1.00C. Trộn đều dịch nuôi cấy và môi trường. Ủ sơ bộ các đĩa ở nhiệt độ phòng (20 - 25 0C) trong 1-2 giờ. Đổ thêm 10-15ml VRB agar đã được làm nguội ở 45.00 +1.00C . Tỷ lệ môi trường giữa hai lần đổ ít nhất là 1:2.
Đọc kết quả: Chọn các đĩa có số khuẩn lạc điển hình và không quá 100 để đếm. Khuẩn lạc coliform chịu nhiệt điển hình có màu đỏ sậm, đường kính ít nhất là 0,5mm, xung quanh khuẩn lạc có vùng kết tủa đỏ.
Khẳng định:
Coliform chịu nhiệt : Chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ của mỗi loại, cấy vào môi trường canh EC, ủ ở 44.0 + 0.50C trong 24±3 h. Phản ứng được xem là dương tính khi trong ống Durham có khí.
E. coli:Test dương tính của Coliform chịu nhiệt được thực hiện thêm về khả năng tạo indol trong môi trường canh tryptone bằng cách thêm 0.3- 0.5 ml thuốc thử Kovac's trực tiếp vào trong môi trường Tryptone đã được ủ ở 44.0 + 0.5 0C trong 24±3 h. Phản ứng được xem dương tính khi có màu đỏ xuất hiện trên bề mặt. Màu vàng hay màu cam xuất hiện trong 10 phút được xem là âm tính. E.coli giả định cho phản ứng indol dương tính.
Báo cáo kết quả: Đếm kết quả bằng cách nhân số khuẩn lạc đã đếm với nồng độ pha loãng và tỷ lệ khẳng định dương tính.
Các chú ý và giới hạn của phương pháp
Thuốc thử Kovacs’ là mối nguy cho sức khỏe, vì vậy cần sử dụng các biện pháp chống độc như đeo khẩu trang và pha thuốc thử trong tủ hốt.
Không được thanh trùng môi trường VRB và đun quá nhiệt.
Rót môi trường E.C vào các ống nghiệm có ống Durrham đảo ngược. Các ống này sẽ chìm xuống sau khi hấp thanh trùng.
Tỷ lệ độ dày giữa lớp trên và lớp dưới của môi trường VRB nên là 2:1.