III. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬ T
3.2.3Phương pháp lai khuẩn lạc
Lai khuẩn lạc là phương pháp kết hợp giữa phương pháp lai phân tử và phương pháp nuôi cấy truyền thống trong việc phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật trong các mẫu. Sau thời gian nuôi cấy trên bề mặt môi trường thạch, các khuẩn lạc vi khuẩn được chuyển lên màng lai, các khuẩn lạc này được ly giải trong môi trường kiềm hay xử lý bằng emzym, sau đó tiến hành lai phân tử. Phương
pháp này phụ thuộc vào khả năng phát triển của vi sinh vật mục tiêu trên môi trường, chúng không phụ thuộc sự phát triển các các quần thể vi sinh vật khác. Sự phát triển của vi sinh vật mục tiêu trong môi trường làm gia tăng số lượng bản sao của các gen mục tiêu, vì thế chúng sẽ gia tăng khả năng phát hiện của các mẫu dò.
Nguyên tắc của phương pháp này được phát triển đầu tiên bởi M. Grunstein và S.D. Hogness (1975) nhằm mục đích sàng lọc trên đĩa có mật độ cao cho các dòng nuôi cấy thuần. Trong qui trình nuôi cấy khuẩn lạc vi khuẩn phát triển trên môi trường rắn được chuyển lên một giá đở phù hợp như màng nitrocellulose, ly giải để tách DNA và biến tính chúng sau đó cố định chúng trên màng. Màng lọc cố định DNA được ủ với mẫu dò. Mẫu dò được tách ra từ một đoạn thông tin di truyền. Và được đánh dấu bằng các các đống vị phóng xạ như 32P hay các chất phát quang khác như biotin. Hiện tượng lai được din ra nếu các trình tự base của các tế bào được ly giải tương đồng với các trình tự trên mẫu dò để hình thành các đoạn lai mạch đôi. Các đoạn lai này được phát hiện bằng bằng các film phóng xạ tự ghi khi các mẫu dò được đánh dầu bằng các đồng vị phóng xạ, hay các film nhạy sáng khi các mẫu dò được đánh dấu bằng biotin. Bằng phương pháp này, các đặc điểm di truyền đặc trưng được phát hiện một cách chuyên biệt. Nếu chọn mẫu dò đặc trưng cho một nhóm vi sinh vật, phương pháp này có thể phát hiện và định lượng nhóm vi sinh vật đó trong mẫu.
Mẫu dò được lai với các vi sinh vật có nguồn gốc từ mẫu, hay các dòng thuần được phân lập và nuôi cấy thứ cấp. Bằng phương pháp này có thể cải thiện được các bất tiện trong quá trình phân tích bằng phương pháp nuôi cấy thuần tuý như:
- Tránh được những sai lệch trong quá trình đếm khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy chọn lọc.
- Chắc chắn phát hiện được các dòng mang kiểu gen mục tiêu cần phát hiện dù các gen đó không hay biểu hiện rất kém trong một sốđiều kiện nuôi cấy.
- Có thể phân tích được các vi sinh vật bị tress hay không thể nuôi cấy được trên các môi trường chọn lọc bằng cách thay thế bằng môi trường không chọn lọc hay môi trường dinh dưỡng tối đa.
- Giảm được thời gian phân tích bằng cách giảm thời gian nuôi cấy, quá trình định lượng giả định và thời gian khằng định kiểu gen hay kiểu hình.
Phương pháp lai khuẩn lạc cũng được sử dụng để khẳng định các dòng vi sinh vật nghi ngờđã được làm thuần.
Ứng dụng chủ yêu của phương pháp lai khuẩn lạc là phát hiện, định lượng và phân lập các vi sinh vật có kiểu hình và kiểu gen đặc trưng. Và được sử dụng đặc biệt trong việc kiểm soát sự hiện diện và hoạt động của các dòng vi sinh vật
trong môi trường. Nghiên cứu sự phân bố các vi sinh vật kháng kháng sinh, kháng kim loại nặng trong nước trong các mẫu môi trường và trong thực phẩm.