IV. ÁP DỤNG ĐỐI VỚI MỘT SỐ VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM
4.3 Định lượng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, E Coli giả định (Fecal Coliforms) bằng
(Fecal Coliforms) bằng phương pháp MPN
Trong phương pháp này:
Coliforms là những vi sinh vật sinh hơi trong môi trường canh Lauryl sulphate và canh Brilliant green lactose bile salt nuôi ủ ở 37.0oC ± 1.00C/ 2 ngày.
Coliforms chịu nhiệt là những vi sinh vật sinh hơi trong môi trường canh EC nuôi ủ ở 44.5oC ± 0.2 0C/1 ngày.
E. coli giả định (Coliforms phân) là Coliforms chịu nhiệt sinh indole trong canh trypton nuôi ủ ở 44.5oC ± 0.2 0C/ 1 ngày
Nguyên tắc:
Số lượng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, E.coli giả định (Coliforms
phân) và E.coli được xác định bằng phương pháp MPN, phương pháp này dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân (hai nồng độ kế tiếp chênh nhau 10 lần) và đưa vào các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp, ủ và đọc số ống cho kết quả dương tính. Số ống nghiệm cho phản ứng dương tính của các nồng độ pha loãng được tra theo bảng MPN để xác định tổng số vi khuẩn trong 1 g (hoặc 1 ml) mẫu.
Môi trường và thuốc thử:
-Canh Lauryl sulphate (Sodium dodecyl sulphate - LSB) -Canh Brilliant green lactose bile salt (BGBL)
-Canh EC (E.coli medium) -Canh Tryptone -Thuốc thử Kovac’s Thiết bị: -Bể điều nhiệt 44.5oC ± 0.2 0C -Tủ ấm 37.0oC + 1.00C Tiến hành: - Coliforms:
Cấy 1 ml dịch mẫu đã pha loãng 1:9 vào dãy 5 ống nghiệm, mỗi ống chứa 10 ml canh Lauryl sulphate. Thực hiện tương tự với dịch mẫu đã pha loãng 1:10 và 1:100. Nếu nghi ngờ lượng vi sinh vật trong mẫu quá cao, phải tăng độ pha loãng mẫu. Ủ ở 37.0oC + 1.00C/2 ngày. Ghi nhận số ống có sinh hơi sau ủ 1 ngày và 2 ngày.
Dùng khuyên cấy cấy chuyển dịch mẫu từ các ống LSB dương tính (ống sinh hơi) sang các ống có chứa canh Brilliant green lactose bile salt. Ủ ở 37.0oC ± 1.00C/2 ngày. Đọc số lượng các ống cho kết quả dương tính(ống sinh hơi). Số ống nghiệm cho phản ứng dương tính của các nồng độ pha loãng được tra theo bảng MPN để xác định tổng sốColiforms trong 1 g (hoặc 1 ml) mẫu.
- Coliforms chịu nhiệt:
Dùng khuyên cấy cấy chuyển dịch mẫu từ các ống canh Lauryl sulphate có sinh hơi sang môi trường canh EC, ủ ở 44.5oC ± 0.2 0C/1 ngày. Đọc số lượng các ống cho kết quả dương tính(ống sinh hơi). Số ống nghiệm cho phản ứng dương tính của các nồng độ pha loãng được tra theo bảng MPN để xác định tổng số Coliformschịu nhiệt trong 1 g (hoặc 1 ml) sản phẩm.
- Coliforms phân:
Dùng khuyên cấy cấy chuyển dịch mẫu từ các ống có sinh hơi trên môi trường canh EC sang môi trường canh Trypton, ủ ở 44.5oC ± 0.2oC/1ngày. Nhỏ thuốc thử Kovac’s vào các ống nghiệm Trypton đã ủ. Phản ứng dương tính khi có màu đỏ xuất hiện trong môi trường trong vòng vài phút. Đọc số lượng các ống cho kết quả dương tính. Số ống nghiệm cho phản ứng dương tính của các nồng độ pha loãng được tra theo bảng MPN để xác định tổng số Coliforms phân trong 1g (hoặc 1ml) mẫu.
Các chú ý và giới hạn của phương pháp:
Phương pháp MPN thông qua phản ứng lên men lactose không định lượng được vi sinh vật thuần chủng. Kết quả sai có thể xảy ra do sự có mặt của các vi sinh vật lên men lactose khác. Không nên cấy chuyển các bọt bóng có sau quá trình đồng nhất mẫu vào môi trường nuôi cấy.
Sau khi chuyển dịch pha loãng mẫu vào ống Lauryl tryptose nên xoay từ từống nghiệm để dịch dính ở thành ống đi xuống.
Có thể có kết quả âm tính giả do sự có mặt của các Coliforms không lên men lactose.
Nhiệt độ bể điều nhiệt cần được duy trì ở 44.50C và mực nước phải trên mực dung dịch trong các ống nghiệm. Nhiệt độủ ấm rất quan trọng, sự thay đổi chút ít có thể làm thay đổi loại và số lượng vi sinh vật phát triển trong môi trường thử nghiệm.
Các chủng loại chuẩn E. coli và Enterobacter aerogenes cấy song song với phép thử sẽ chỉ ra sự sai lệch của nhiệt độ bể điều nhiệt. Nhiệt độ cao sẽ dẫn đến sự lên men của E.coli sai. Sự lên men lactose của E. aerogenes chỉ ra nhiệt độ ủ thấp hơn 44.50C.
Định lượng E.coli bằng Lauryl tryptose broth có thể xuất hiện âm tính giả do E.coli bị tổn thương trong quá trình chế biến thực phẩm.
Nên sử dụng chủng chứng và kiểm soát môi trường trong suốt quá trình thử nghiệm.