1. Đầu và vỏ tôm
Đầu và vỏ Penaeus vannamei
Đầu và vỏ tôm tƣơi sau khi thu mua đƣợ ệt trong thùng xốp
v ầu, vỏ tôm đƣợc cấp đông
và ệ -20oC để dùng thí nghiệm trong nghiên cứu này.
Các mẫu đƣợc rã đông trong thùng xốp và làm tơi trƣớc khi thí nghiệm.
2. Enzyme Pepsin
Enzyme Pepsin đƣợc mua của hãng Merck – Đức. Enzyme Pepsin (mã 1 07185 0100) thu từ niêm mạc dạ dày lợn, có hoạt độ 0,7 FIP – U/mg [41].
3. Hóa chất, thiết bị
2.1.3.1. Hóa chất
-Hóa chất xử lý:
Natri hydroxit 85%, acid clohydric 36 – 38%, giấy lọc Trung Quốc.
-Hóa chất phân tích:
Natri hydroxit 98%, acid acetic 100%, acid photphoric 85%, potassium sodium tartrate 99,9%, kali natri tartrate 99,9%, đồng sunfat 99%, sodium citrate 99,9%, natricacbonat 99%, huyết thanh bò (BSA) 99%, N acetyl glucosamine 99% Merck.
2.1.3.2. Thiết bị
Bể ổn nhiệt: mô đen Memmert Wnb 29 (L1), 29 lít; Memmert, Đức. Máy vortex: mô đen ZX3; Velp, Italy. Thiết bị đo UV vis: mô đen Cary 100; Varian, Mỹ. Máy đo pH: mô đen pH testr 30; Eutech, Singapore. Cân điện tử: mô đen V11P – Ohaus; Ohaus, Mỹ. Tủ nung: mô đen B150; Nabertherm, Đức. Tủ sấy: mô đen UM 400; Memmert, Đức
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Bố trí thí nghiệm theo phƣơng pháp cổ điển và quy hoạch thực nghiệm
2.3. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm
1. Bố trí thí nghiệm tổng quát
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
XĐ thành phần hóa học
Nguyên liệu (đầu/vỏ tôm)
Tan giá, làm tơi
Nghiên cứu chế độ xử lý cơ học
Dịch Bã
Nghiên cứu khử khoáng lần 1 với HCl
Nghiên cứu xử lý với Pepsin kết hợp khử khoáng lần 2 với HCl
Đề xuất quy trình
Nghiên cứu xử lý với NaOH
Thuyết minh
1. Nguyên liệu
Nguyên liệu nghiên cứu là đầu và vỏ tôm đƣợc xử lý riêng, cấp đông đƣợc rã đông và làm tơi trƣớc khi sử dụng. Một phần nguyên liệu kiểm tra thành phần hóa học cơ bản. Phần còn lại đƣợc ép tách dịch, bã kiểm tra thành phần hóa học cơ bản và tiến hành nghiên cứu.
2. Xử lý với HCl
Bã đầu tôm, vỏ tôm đƣợc bổ sung HCl 2% với tỷ lệ 1/3 và 1% với tỷ lệ 1/4 (w/v) tƣơng ứng. Sau khi xử lý ở nhiệt độ phòng với thời gian 0,5, 1, 2, 3, 4 giờ tiến hành lọc rửa thu phần rắn phơi khô và kiểm tra hàm lƣợng protein, khoáng còn lại. Từ đó lựa chọn thời gian khử khoáng thích hợp xử lý các công đoạn tiếp theo.
3. Xử lý với Pepsin
Sau xử lý với HCl vắt ráo phần rắn thu đƣợc, tiến hành bổ sung nƣớc, điều chỉnh pH 2 ± 0,2 bằng acid HCl 1% rồi bổ sung enzyme Pepsin ở các nồng độ khác nhau và tiến hành quá trình thủy phân ở các điều kiện nhiệt độ, thời gian khác nhau nhằm nghiên cứu ảnh hƣởng của các yếu tố tỷ lệ enzyme, nhiệt độ và thời gian xử lý đến HQKK và HQKP của enzyme Pepsin, từ đó xác định đƣợc các yếu tố cần nghiên cứu cho việc tối ƣu hóa quá trình xử lý với enzyme Pepsin. Chitin thô thu đƣợc theo chế độ xử lý tối ƣu với Pepsin sẽ đƣợc kiểm tra hàm lƣợng protein, khoáng còn lại để lựa chọn chế độ xử lý tiếp theo, nếu cần.
4. Xử lý với NaOH
Sau xử lý bằng enzyme Pepsin ở chế độ tối ƣu chitin thô đƣợc xử lý với NaOH ở các điều kiện nồng độ, thời gian, nhiệt độ khác nhau đảm bảo hàm lƣợng protein, khoáng còn lại trên chitin nhỏ hơn 1%.
2. Xác định ảnh hƣởng của việc xử lý cơ học bằng phƣơng pháp ép đến hàm lƣợng protein, khoáng của nguyên liệu đầu, vỏ tôm thẻ chân trắng
Mục đích: Xác định thành phần hóa học cơ bản của đầu, vỏ tôm thẻ nguyên
liệu trƣớc và sau khi ép để xác định biện pháp xử lý thích hợp trƣớc khi đƣa vào quá trình sản xuất chitin. Ngoài ra xác định thành phần hóa học của nguyên liệu trƣớc và sau khi ép có ý nghĩa quan trọng trong việc xác định các thông số cho các công đoạn xử lý tiếp theo nhƣ khử protein, khoáng.
Tiến hành: Đầu, vỏ tôm bảo quản đông đƣợc rã đông làm tơi. Một phần đƣợc
ép loại dịch và tách nƣớc, một phần nguyên liệu chƣa ép và bã ép đầu vỏ tôm đƣợc kiểm tra thành phần hóa học cơ bản: độ ẩm, hàm lƣợng protein, khoáng theo sơ đồ.
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thành phần hóa học cơ bản của đầu, vỏ tôm nguyên liệu, bã ép đầu, vỏ tôm thẻ chân trắng
Nguyên liệu (đầu/vỏ tôm)
Tan giá, làm tơi
Xử lý cơ học Dịch Bã Xác định hàm lƣợng khoáng Xác định hàm lƣợng protein Xác định hàm lƣợng ẩm Loại bỏ
3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của quá trình xử lý với HCl đến hàm lƣợng protein,
khoángtrên đầu, vỏ tôm thẻ chân trắng
Mục đích: Xử lý đầu vỏ tôm với HCl giúp loại một lƣợng khoáng đáng kể và
một phần protein trên nguyên liệu tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình khử protein tiếp theo.
Tiến hành: Bã đầu tôm, vỏ tôm đƣợc bổ sung HCl 2% với tỷ lệ 1/3 và 1% với
tỷ lệ 1/4 (w/v) tƣơng ứng. Sau khi xử lý ở nhiệt độ phòng với thời gian 0,5, 1, 2, 3, 4 giờ tiến hành lọc rửa thu phần rắn phơi khô và kiểm tra hàm lƣợng protein, khoáng còn lại. Từ đó lựa chọn thời gian khử khoáng thích hợp xử lý các công đoạn tiếp theo.
Hình 2.3. Sơ đồ khảo sát ảnh hƣởng của quá trình xử lý với HCl đến hàm lƣợng protein, khoáng trên vỏ tôm thẻ chân trắng
Nguyên liệu (đầu/vỏ tôm)
Xử lý với HCl
Vỏ tôm: HCl 1%, nhiệt độ thƣờng, tỷ lệ 1/4 (w/v) Đầu tôm: HCl 2%, nhiệt độ
thƣờng, tỷ lệ 1/3 (w/v)
Lựa chọn chế độ xử lý thích hợp
Lọc, rửa bã, làm khô
XĐ hàm lƣợng khoáng XĐ hàm lƣợng protein
4. Nghiên cứu chế độ xử lý đầu, vỏ tôm với Pepsin
2.3.4.1. Nghiên cứu chế độ xử lý với Pepsin trên vỏ tôm thẻ chân trắng
Bố trí thí nghiệm tổng quát
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát nghiên cứu chế độ xử lý với Pepsin trên vỏ tôm thẻ chân trắng
Bã ép vỏ tôm
Xử lý với HCl
Đánh giá khả năng sử dụng Pepsin
Xác định các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt động của Pepsin
Thời gian xử lý Mức độ khử khoáng Lựa chọn chế độ xử lý thích hợp Chitin thô XĐ hàm lƣợng khoáng XĐ hàm lƣợng protein Nhiệt độ xử lý Xác định mức độ ảnh hƣởng và sự tƣơng tác của các yếu tố đến hoạt
động của Pepsin
Tối ƣu hóa quá trình xử lý với enzyme Pepsin
1. Khảo sát khả năng sử dụng Pepsin trên vỏ tôm thẻ chân trắng
Mục đích: Xác định khoảng nồng độ Pepsin cho hiệu quả tích cực đến khả
năng khử protein và khoáng trên vỏ tôm, đồng thời đánh giá tác động của việc phân ly hoặc không phân ly dịch xử lý với HCl từ đó khảo sát khả năng sử dụng Pepsin và lựa chọn chế độ xử lý tiếp theo.
Tiến hành: Bã ép vỏ tôm bảo quản đông đƣợc rã đông và làm tơi. Bổ sung HCl
1% tỷ lệ nguyên liệu/acid là 1/4 (w/v). Sau xử lý bằng HCl theo thời gian đã chọn, tiến hành phân ly loại dịch hoặc không phân ly. Tiếp tục bổ sung nƣớc và điều chỉnh pH đạt 2 ± 0,2 bằng HCl 1%. Bổ sung Pepsin nồng độ 10 U/g pro, thủy phân trong 6 giờ ở
37oC. Sau khi thủy phân tiến hành lọc rửa thu phần rắn phơi khô và kiểm tra hàm
lƣợng protein, khoáng còn lại theo sơ đồ.
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng sử dụng Pepsin trên vỏ tôm thẻ chân trắng
Kết luận về khả năng sử dụng Pepsin
Lọc, rửa bã, làm khô
XĐ hàm lƣợng khoáng XĐ hàm lƣợng protein
[E]=5 U/g pro
[E]=0 U/g pro [E]=10 U/g pro
Bổ sung nƣớc và HCl 1% để pH = 2 ± 0,5
Không phân ly Phân ly
Bã
Bổ sung Pepsin, xử lý ở 37oC trong 6 giờ
Xử lý với HCl Bã ép vỏ tôm
2. Khảo sát sự ảnh hƣởng của thời điểm bổ sung Pepsin đến HQKP và HQKK
Mục đích: Thời gian khử khoáng với HCl có ảnh hƣởng đến hàm lƣợng
khoáng còn lại và mức độ rỗng xốp của vỏ tôm trƣớc khi xử lý với Pepsin. Điều này có thể ảnh hƣởng đến HQKP của enzyme Pepsin. Do đó cần khảo sát ảnh hƣởng của thời gian khử khoáng để xác định thời điểm bổ sung Pepsin hợp lý để hiệu quả thủy phân protein của Pepsin là cao nhất.
Tiến hành: Vỏ tôm bảo quản đông đƣợc rã đông, làm tơi. Mỗi mẫu cân 100g
bổ sung HCl 1% tỷ lệ nguyên liệu/acid 1/4 (w/v). Tiến hành khử khoáng trong 0,5, 1, 2, 3, 4 giờ và mẫu đối chứng không bổ sung HCl 1%. Sau đó phân ly hoặc không phân ly theo kết quả thí nghiệm trên. Bổ sung enzyme Pepsin với nồng độ 10 U/g pro và các
mẫu đối chứng không bổ sung enzyme, thủy phân trong 6 giờ ở 37oC. Sau khi thủy
phân tiến hành lọc rửa thu phần rắn phơi khô và kiểm tra hàm lƣợng protein, khoáng còn lại để đánh giá chọn chế độ thích hợp.
Hình 2.6. Sơ đồ khảo sát ảnh hƣởng của thời điểm bổ sung enzyme đến HQKK và HQKP của enzyme Pepsin
Xử lý thống kê, so sánh và đƣa ra kết luận
Bã, rửa, làm khô
XĐ hàm lƣợng khoáng XĐ hàm lƣợng protein
Xử lý không bổ sung Pepsin, pH 2 ± 0,2
thời gian 6 giờ, nhiệt độ 37oC
Xử lý HCl 1%, tỷ lệ 1/4 (w/v)
Xử lý với Pepsin 10 U/g pro, pH 2 ± 0,2
thời gian 6 giờ, nhiệt độ 37oC
Vỏ tôm rã đông, làm tơi
3. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ xử lý với Pepsin đến HQKP và HQKK
Mục đích: Mỗi enzyme có nhiệt độ hoạt động tối ƣu khác nhau. Theo nhà sản
xuất enzyme Pepsin sử dụng có hoạt động tối ƣu 37oC tuy nhiên với từng cơ chất cụ
thể nhiệt độ này có thể thay đổi. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ đƣợc thực hiện ở
các nhiệt độ 30, 37 và 43oC trong bể ổn nhiệt để đánh giá ảnh hƣởng của nhiệt độ xử
lý với Pepsin đến HQKP và HQKK. Các giá trị nhiệt độ này tƣơng ứng với nhiệt đội môi trƣờng, nhiệt độ tối thích của enzyme theo nhà sản xuất và nhiệt độ khi gia nhiệt bằng ánh nắng mặt trời.
Tiến hành: Bã ép vỏ tôm sau khi ép đƣợc làm tơi, bổ sung HCl 1% tỷ lệ
nguyên liệu/acid 1/4 (w/v). Chọn thời gian xử lý với HCl, phân ly hoặc không phân ly dịch tùy theo kết quả nghiên cứu ở thí nghiệm trên. Bổ sung nƣớc và điều chỉnh pH 2 ± 0,2 bằng HCl 1%. Sau đó bổ sung enzyme Pepsin với nồng độ 10 U/g pro và mẫu
đối chứng không bổ sung enzyme, thủy phân trong 6 giờ ở nhiệt độ 30o
C, 37oC, 43oC.
Sau khi thủy phân tiến hành lọc rửa thu phần rắn phơi khô và kiểm tra hàm lƣợng protein, khoáng còn lại để đánh giá chọn chế độ thích hợp.
Hình 2.7. Sơ đồ khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng khử khoáng, khử protein trong vỏ tôm khi kết hợp xử lý bằng HCl và Pepsin
Xử lý thống kê, so sánh và đƣa ra kết luận
Lọc, rửa bã, làm khô
XĐ hàm lƣợng khoáng XĐ hàm lƣợng protein
Xử lý không bổ sung Pepsin, pH 2 ± 0,2, thời gian 6 giờ
Xử lý HCl 1%, tỷ lệ 1/4 (w/v), nhiệt độ thƣờng
Xử lý với Pepsin 10 U/gpro, pH 2 ± 0,2, thời gian 6 giờ
37oC
30oC 43oC
4. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian xử lý với Pepsin đến HQKP và HQKK
Mục đích: Thời gian là một yếu tố có ảnh hƣởng đến khả năng hoạt động của
enzyme. Thông thƣờng, hiệu quả hoạt động của enzyme tăng không đáng kể khi vƣợt qua khoảng thời gian cần thiết cho phản ứng. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian xử lý với Pepsin đến HQKP và HQKK để từ đó chọn thời gian thích hợp sử dụng Pepsin đạt hiệu quả cao nhất.
Tiến hành: Bã vỏ tôm sau ép tách làm tơi, bổ sung HCl 1% tỷ lệ nguyên
liệu/acid là 1/4 (w/v). Chọn thời gian khử khoáng và phân ly hoặc không phân ly dịch tùy theo kết quả nghiên cứu ở thí nghiệm trên. Bổ sung nƣớc và điều chỉnh pH đạt 2 ± 0,2 bằng HCl 1%. Sau đó bổ sung enzyme Pepsin với nồng độ 10 U/g pro và mẫu đối chứng không bổ sung enzyme, thủy phân trong các khoảng thời gian 6, 9, 12 và 15 giờ
ở 37oC. Sau khi thủy phân tách bã rửa, làm khô và kiểm tra các chỉ tiêu hàm lƣợng
khoáng, protein còn lại để đánh giá chọn chế độ thích hợp.
Hình 2.8. Sơ đồ khảo sát ảnh hƣởng của thời gian đến khả năng khử khoáng, khử protein trong vỏ tôm khi kết hợp xử lý bằng HCl và Pepsin
Xử lý thống kê, so sánh và đƣa ra kết luận
Lọc, rửa bã, làm khô
XĐ hàm lƣợng khoáng XĐ hàm lƣợng protein
Xử lý HCl 1%, tỷ lệ 1/4 (w/v), nhiệt độ thƣờng
Xử lý với Pepsin 10 U/g pro,
pH 2 ± 0,2, nhiệt độ 37oC
Vỏ tôm rã đông, làm tơi
6 giờ 9 giờ 12 giờ 15 giờ
Xử lý không bổ sung enzyme,
5. Khảo sát mức độ ảnh hƣởng và sự tƣơng tác của các yếu tố đến HQKP và HQKK của Pepsin
Mục đích: Trong quá trình xử lý với Pepsin trên vỏ tôm có sự ảnh hƣởng của
các yếu tố nhiệt độ, nồng độ enzyme và thời gian xử lý đồng thời xảy ra sự tƣơng tác giữa các yếu tố này. Khảo sát ảnh hƣởng và sự tƣơng tác của các yếu tố trong quá trình xử lý với Pepsin đến HQKP và HQKK để từ đó lựa chọn khoảng tối ƣu của các yếu tố đó.
Tiến hành: Bã vỏ tôm thẻ sau ép tách làm tơi, bổ sung HCl 1% tỷ lệ nguyên
liệu/acid 1/4 (w/v). Chọn thời gian khử khoáng và phân ly hoặc không phân ly dịch tùy theo kết quả nghiên cứu ở thí nghiệm trên. Bổ sung nƣớc và điều chỉnh pH đạt 2 ± 0,2 bằng HCl 1%. Tiếp tục bổ sung Pepsin với nồng độ khác nhau, thủy phân ở nhiệt độ, thời gian theo mô hình 2 level – factorial với 3 biến đƣợc thể hiện Bảng 2.1. Sau khi thủy phân tách bã rửa, làm khô và kiểm tra các chỉ tiêu hàm lƣợng khoáng, protein còn lại để đánh giá chọn chế độ thích hợp.
Bảng 2.1. Bảng mã hóa các nhân tố nghiên cứu
Nhân tố Nhân tố
đƣợc mã hóa
Đơn vị Mức nghiên cứu
-1 0 1
Nhiệt độ X1 oC 30 35 40
Nồng độ E X2 U/g pro 5 12,5 20
Thời gian X3 Giờ 6 12 18
6. Tối ƣu hóa quá trình khử protein bằng enzyme Pepsin kết hợp với khử khoáng
bằng HCl
Mục đích: Tìm đƣợc các thông số tối ƣu cho công đoạn khử protein với Pepsin
kết hợp khử khoáng bằng HCl trên vỏ tôm thẻ chân trắng.
Tiến hành: Bã vỏ tôm sau ép tách làm tơi, bổ sung HCl 1% tỷ lệ nguyên
liệu/acid 1/4 (w/v). Chọn thời gian khử khoáng và phân ly hoặc không phân ly dịch tùy theo kết quả nghiên cứu ở thí nghiệm trên. Bổ sung enzyme Pepsin với nồng độ khác nhau, thủy phân ở nhiệt độ, thời gian theo mô hình Box-Behneken với 3 biến dựa theo kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của các yếu tố đến HQKP và HQKK của Pepsin. Sau khi thủy phân tách bã tiến hành rửa, làm khô và tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu hàm
lƣợng khoáng, protein còn lại để đánh giá chọn chế độ thích hợp với h
HQKP (Y) bằng Pepsin. Y max
Phƣơng trình hồi quy:
Y= bo + b1X1+ b2X2+ b3X3+ b12X1X2+ b23X2X3+ b13X1X3+ b11X12+ b22X22+ b33X32
2.3.4.2. Nghiên cứu chế độ xử lý với Pepsin trên bã đầu tôm thẻ chân trắng
Bố trí thí nghiệm
Hình 2.9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát chế độ xử lý với Pepsin trên đầu tôm thẻ chân trắng
Bã ép đầu tôm
Xử lý với HCl
Đánh giá khả năng sử dụng Pepsin
Lựa chọn chế độ xử lý thích hợp