Nhân tố Nhân tố
đƣợc mã hóa
Đơn vị Mức nghiên cứu
-1 0 1
Nhiệt độ X1 oC 30 35 40
Nồng độ E X2 U/g pro 5 12,5 20
Thời gian X3 Giờ 6 12 18
6. Tối ƣu hóa q trình khử protein bằng enzyme Pepsin kết hợp với khử khoáng
bằng HCl
Mục đích: Tìm đƣợc các thơng số tối ƣu cho công đoạn khử protein với Pepsin
kết hợp khử khống bằng HCl trên vỏ tơm thẻ chân trắng.
Tiến hành: Bã vỏ tôm sau ép tách làm tơi, bổ sung HCl 1% tỷ lệ nguyên
liệu/acid 1/4 (w/v). Chọn thời gian khử khống và phân ly hoặc khơng phân ly dịch tùy theo kết quả nghiên cứu ở thí nghiệm trên. Bổ sung enzyme Pepsin với nồng độ khác nhau, thủy phân ở nhiệt độ, thời gian theo mơ hình Box-Behneken với 3 biến dựa theo kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của các yếu tố đến HQKP và HQKK của Pepsin. Sau khi thủy phân tách bã tiến hành rửa, làm khô và tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu hàm
lƣợng khống, protein cịn lại để đánh giá chọn chế độ thích hợp với h
HQKP (Y) bằng Pepsin. Y max
Phƣơng trình hồi quy:
Y= bo + b1X1+ b2X2+ b3X3+ b12X1X2+ b23X2X3+ b13X1X3+ b11X12+ b22X22+ b33X32
2.3.4.2. Nghiên cứu chế độ xử lý với Pepsin trên bã đầu tơm thẻ chân trắng Bố trí thí nghiệm
Hình 2.9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát chế độ xử lý với Pepsin trên đầu tôm thẻ chân trắng
Bã ép đầu tôm
Xử lý với HCl
Đánh giá khả năng sử dụng Pepsin
Lựa chọn chế độ xử lý thích hợp
Chitin thơ
XĐ hàm lƣợng khống XĐ hàm lƣợng protein
Xác định sự tƣơng tác các yếu tố đến hoạt động của Pepsin
Tối ƣu hóa q trình xử lý với enzyme Pepsin
1. Khảo sát khả năng sử dụng Pepsin trên bã đầu tơm thẻ chân trắng
Mục đích: Đánh giá khả năng sử dụng hoặc không sử dụng enzyme Pepsin trên
bã ép đầu tôm cũng nhƣ ảnh hƣởng của việc xử lý cơ học đầu tơm để từ đó đƣa ra biện pháp thích hợp giúp tách/khử protein trên đầu tôm.
Tiến hành: Bã ép đầu tôm đƣợc làm tơi, xử lý với HCl 2% tỷ lệ nguyên
liệu/acid 1/3 (w/v) ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ. Loại dịch khử khoáng, bổ sung nƣớc và điều chỉnh pH đạt pH 2 ± 0,2 bằng HCl 1%. Sau đó bổ sung hoặc khơng bổ sung
enzyme theo sơ đồ bố trí thí nghiệm Hình 2.10 và tiến hành ủ ở 40o
C trong 6 giờ. Tiếp theo xay mẫu với nƣớc tỷ lệ 1/5 (w/v), tiến hành lọc rửa thu phần rắn phơi khô và kiểm tra hàm lƣợng protein, khống cịn lại. Đánh giá chọn chế độ xử lý thích hợp.
Hình 2.10. Sơ đồ khảo sát khả năng sử dụng Pepsin trên đầu tôm thẻ chân trắng Xử lý cơ học Lựa chọn chế độ xử lý thích hợp Lọc, rửa bã, làm khơ XĐ hàm lƣợng khống XĐ hàm lƣợng protein Không xử lý cơ học Xử lý HCl 2%, tỷ lệ 1/3 (w/v)
Xử lý với Pepsin 10 U/g.pro,
pH 2 ± 0,5 ở 40oC trong 6 giờ
Đầu tôm rã đông, làm tơi
Xử lý pH 2 ± 0,5 ở 40oC trong
2. Khảo sát ảnh hƣởng thời điểm bổ sung Pepsin đến HQKP và HQKK
Mục đích: Thời điểm bổ sung enzyme và xử lý cơ học sẽ có ảnh hƣởng nhất
định đến khả năng loại protein trên đầu tôm (khả năng tách vỏ đầu và khử protein). Khảo sát ảnh hƣởng của thời điểm bổ sung enzyme cần đƣợc thực hiện để xác định thời điểm bổ sung sao cho thu đƣợc hiệu quả xử lý tốt nhất.
Tiến hành: Đầu tôm bảo quản đông đƣợc rã đông và làm tơi, xử lý với HCl 2%
tỷ lệ nguyên liệu/acid 1/3 (w/v) ở nhiệt độ phịng trong 2 giờ. Loại dịch khử khống, bổ sung nƣớc và điều chỉnh pH đạt pH 2 ± 0,2 bằng HCl 1%. Tiến hành xử lý ở 2 chế
độ: Chế độ 1: Bổ sung enzyme Pepsin 10U/g pro thủy phân 40oC trong 6 giờ, sau đó
xay với nƣớc tỷ lệ nguyên liệu/nƣớc 1/5 (w/v). Chế độ 2: Mẫu sau khử khoáng đƣợc xay ở cùng chế độ nhƣ trên, sau đó thu bã bổ sung nƣớc và điều chỉnh pH đạt pH 2 ±
0,2 bằng HCl, bổ sung Pepsin 10U/g pro thủy phân ở 40oC trong 6 giờ. Sau xử lý tiến
hành lọc rửa thu phần rắn phơi khô và kiểm tra hàm lƣợng protein, khống cịn lại để đánh giá và chọn chế độ thích hợp.
Hình 2.11. Sơ đồ khảo sát ảnh hƣởng của thời điểm bổ sung Pepsin đến khả năng tách protein, khống trên vỏ tơm thẻ
Xử lý cơ học
Xử lý HCl 2%, tỷ lệ 1/3(w/v), nhiệt độ phòng, thời gian 2 giờ
Tách vỏ đầu, bổ sung nƣớc 1/3 (w/v), điều chỉnh pH 2 ± 0,2 bằng HCl 1%, bổ sung
Pepsin [E] 10 U/g pro, xử lý ở 40oC, 6 giờ
Bã ép đầu tôm
Xử lý cơ học
Lựa chọn chế độ xử lý thích hợp
Lọc, rửa bã, làm khơ
XĐ hàm lƣợng khống XĐ hàm lƣợng protein
Tách vỏ đầu, bổ sung nƣớc 1/3 (w/v), điều chỉnh pH 2 ± 0,2 bằng HCl 1%, bổ sung
3. Khảo sát mức độ ảnh hƣởng và sự tƣơng tác của các yếu tố đến HQKP của enzyme Pepsin
Mục đích: Trong q trình xử lý với Pepsin trên đầu tơm có sự ảnh hƣởng của
các yếu tố nhiệt độ, nồng độ enzyme và thời gian xử lý đồng thời xảy ra sự tƣơng tác giữa các yếu tố này. Khảo sát ảnh hƣởng và tƣơng tác của các yếu tố trong quá trình thủy phân đến HQKP của Pepsin trên đầu tôm để từ đó chọn miền nghiên cứu cho thí nghiệm tối ƣu hóa q trình khử protein bằng Pepsin.
Tiến hành: Bã đầu tôm sau ép tách làm tơi, bổ sung HCl 2% tỷ lệ nguyên
liệu/acid 1/3 (w/v). Chọn chế độ xử lý cơ học và thời điểm bổ sung Pepsin theo kết quả nghiên cứu trên. Bổ sung nƣớc và điều chỉnh pH đạt pH 2 ± 0,2 bằng HCl, bổ sung Pepsin với nồng độ, thời gian, nhiệt độ khác nhau theo mơ hình 2 level – factorial với 3 biến đƣợc thể hiện Bảng 2.1. Sau khi thủy phân tiến hành lọc rửa thu phần rắn phơi khô và kiểm tra hàm lƣợng protein, khống cịn lại để đánh giá chọn chế độ thích hợp.
Bảng 2.2. Bảng mã hóa các nhân tố nghiên cứu
Nhân tố Nhân tố đƣợc
mã hóa
Đơn vị Mức nghiên cứu
-1 0 1
Nhiệt độ X1 oC 30 35 40
Nồng độ E X2 U/g pro 5 12,5 20
Thời gian X3 giờ 6 12 18
4. Tối ƣu hóa q trình khử protein bằng Pepsin trên đầu tơm thẻ chân trắng
Mục đích: Tìm ra các thơng số tối ƣu cho công đoạn khử protein với Pepsin kết
hợp khử khoáng bằng HCl.
Tiến hành: Bã đầu tôm sau ép tách làm tơi, bổ sung HCl 2% tỷ lệ nguyên
liệu/acid 1/3 (w/v). Cố định chế độ xử lý trƣớc tối ƣu theo các kết quả đã khảo sát. Bổ sung enzyme Pepsin với nồng độ, thời gian dựa theo kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của các yếu tố đến HQKP của enzyme Pepsin theo mơ hình composit. Sau xử lý bằng Pepsin tách bã rửa, làm khô và kiểm tra hàm lƣợng khống, protein cịn lại để đánh giá
chọn chế độ thích hợp. của Pepsin (Y). Y max
Phƣơng trình hồi quy:
5. Nghiên cứu chế độ xử lý NaOH trên đầu, vỏ tôm thẻ chân trắng
2.3.5.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ NaOH đến hàm lƣợng protein còn lại trên chitin sản xuất từ đầu, vỏ tơm
Mục đích: Lựa chọn chế độ xử lý NaOH để hàm lƣợng protein còn lại trên
chitin sản xuất từ đầu, vỏ tôm đạt <1%.
Tiến hành: Bã vỏ tôm sau ép tách làm tơi, bổ sung HCl 1% tỷ lệ nguyên
liệu/acid là 1/4 (w/v). Chọn thời gian khử khống và phân ly hoặc khơng phân ly dịch tùy theo kết quả nghiên cứu ở thí nghiệm trên. Bổ sung nƣớc và điều chỉnh pH đạt 2 ± 0,2 bằng HCl 1%. Sau đó bổ sung enzyme Pepsin với nồng độ, thời gian và nhiệt độ thủy phân theo các chế độ nghiên cứu. Sau khi thủy phân tách bã rửa, tiếp tục xử lý
với NaOH trong 8 giờ ở 70oC theo các nồng độ 0,5; 1; 1,5; 2%. Rửa, làm khô và kiểm
tra các chỉ tiêu hàm lƣợng khống, protein cịn lại để đánh giá chọn chế độ thích hợp.
Hình 2.12. Sơ đồ khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ NaOH đến hàm lƣợng protein cịn lại trên chitin từ đầu, vỏ tơm thẻ chân trắng
Xử lý với HCl
Xử lý với NaOH, nhiệt độ
70oC, thời gian 6 giờ
0,5%
Đầu, vỏ tôm rã đơng, làm tơi
Lựa chọn chế độ xử lý thích hợp 1,5% 1% 2% Xử lý với Pepsin kết hợp HCl Lọc, rửa bã, làm khô XĐ hàm lƣợng protein còn lại
2.3.5.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian xử lý với NaOH đến hàm lƣợng protein cịn lại trên chitin sản xuất từ đầu, vỏ tơm
Mục đích: Lựa chọn chế độ xử lý NaOH để hàm lƣợng protein còn lại trên
chitin sản xuất từ đầu, vỏ tôm đạt <1%.
Tiến hành: Bã vỏ tôm sau ép tách làm tơi, bổ sung HCl 1% tỷ lệ nguyên
liệu/acid là 1/4 (w/v). Chọn thời gian khử khống và phân ly hoặc khơng phân ly dịch tùy theo kết quả nghiên cứu ở thí nghiệm trên. Bổ sung nƣớc và điều chỉnh pH đạt 2 ± 0,2 bằng HCl 1%. Sau đó bổ sung enzyme Pepsin với nồng độ, thời gian và nhiệt độ thủy phân theo các chế độ nghiên cứu. Sau khi thủy phân tách bã rửa, tiếp tục xử lý
với NaOH ở 70oC và nồng độ thích hợp theo kết quả nghiên cứu trên trong 6, 8, 10, 12
giờ. Rửa, làm khô và kiểm tra các chỉ tiêu hàm lƣợng khống, protein cịn lại để đánh giá chọn chế độ thích hợp.
Hình 2.13. Sơ đồ khảo sát ảnh hƣởng của thời gian xử lý NaOH đến hàm lƣợng protein cịn lại trên chitin từ đầu, vỏ tơm thẻ chân trắng
Xử lý với HCl
Xử lý với NaOH, nhiệt độ 70oC
6 giờ
Đầu, vỏ tôm rã đông, làm tơi
Lựa chọn chế độ xử lý thích hợp 10 giờ 8 giờ 12 giờ Xử lý với Pepsin kết hợp HCl Lọc, rửa bã, làm khơ XĐ hàm lƣợng protein cịn lại
2.3.5.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ NaOH đến hàm lƣợng protein còn lại trên chitin sản xuất từ đầu, vỏ tơm
Mục đích: Lựa chọn chế độ xử lý NaOH để hàm lƣợng protein còn lại trên
chitin sản xuất từ đầu, vỏ tôm đạt <1%.
Tiến hành: Bã vỏ tôm sau ép tách làm tơi, bổ sung HCl 1% tỷ lệ nguyên
liệu/acid là 1/4 (w/v). Chọn thời gian khử khống và phân ly hoặc khơng phân ly dịch tùy theo kết quả nghiên cứu ở thí nghiệm trên. Bổ sung nƣớc và điều chỉnh pH đạt 2 ± 0,2 bằng HCl 1%. Sau đó bổ sung enzyme Pepsin với nồng độ, thời gian và nhiệt độ thủy phân theo các chế độ nghiên cứu. Sau khi thủy phân tách bã rửa, tiếp tục xử lý bằng NaOH với nồng độ và thời gian thích hợp theo kết quả nghiên cứu trên ở 60, 70,
80oC. Rửa, làm khô và kiểm tra các chỉ tiêu hàm lƣợng khống, protein cịn lại để đánh
giá chọn chế độ thích hợp.
Hình 2.14. Sơ đồ khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ xử lý NaOH đến hàm lƣợng protein cịn lại trên chitin từ đầu, vỏ tơm thẻ chân trắng
Xử lý với HCl
Xử lý với NaOH, thời gian 8 giờ
60oC
Đầu, vỏ tôm rã đông, làm tơi
Lựa chọn chế độ xử lý thích hợp
70oC 80oC
Xử lý với Pepsin kết hợp HCl
Lọc, rửa bã, làm khơ XĐ hàm lƣợng protein cịn lại
6. So sánh chất lƣợng chitin của quy trình sản xuất chitin thu đƣợc với quy trình tham khảo
Tiến hành: So sánh với quy trình sản xuất chitin dựa theo quy trình kết hợp
phƣơng pháp hóa học và phƣơng pháp sinh học (Trung 2010), đƣợc trình bày chi tiết ở Phụ lục 1
2.4. Phƣơng pháp phân tích
- Xác định hàm lƣợng ẩm theo phƣơng pháp sấy ở 105o
C của AOAC, 1990.
- Xác định hàm lƣợng khoáng tổng số bằng phƣơng pháp nung ở 550oC của
AOAC, 1990.
- Xác định hàm lƣợng protein hòa tan theo phƣơng pháp biuret và microbiuret
của Hein và cộng sự, 2004.
- Xác định độ nhớt theo phƣơng pháp của Roberts và Domszy, 1982.
- Xác định độ hòa tan chitosan theo phƣơng pháp của Kofuji, 2005.
- Xác định khả năng hút nƣớc của chitosan theo phƣơng pháp của No và cộng
sự, 2000.
- Xác định độ deacetyl theo phƣơng pháp của Alonso, 1993.
2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu báo cáo là giá trị trung bình của 3 lần phân tích giá trị p < 0,05 đƣợc xem là có ý nghĩa về mặt thống kê.
Số liệu đƣợc phân tích và vẽ đồ thị trên phần mềm Excel 2007. Tối ƣu hóa đƣợc thực hiện bằng phần mềm Design Expert 8.0
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của việc xử lý cơ học bằng phƣơng pháp ép đến hàm lƣợng protein, khoáng của nguyên liệu đầu, vỏ tơm thẻ chân trắng hàm lƣợng protein, khống của ngun liệu đầu, vỏ tôm thẻ chân trắng
Tiến hành phân tích khảo sát ảnh hƣởng của việc xử lý cơ học bằng phƣơng pháp ép đến hàm lƣợng protein, khoáng của nguyên liệu đầu, vỏ tôm thẻ theo sơ đồ Hình 2.2 thu đƣợc kết quả thể hiện trong Bảng 3.1.