3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
2.2.Nội dung nghiên cứu
- Điều tra hồi cứu về bệnh và thiệt hại kinh tế do dịch cúm gia cầm gây ra tại tỉnh Hà Tây cũ.
- Theo dõi tình hình thực hiện tiêm vaccine phòng dịch cúm gia cầm tại tỉnh Hà Tây cũ theo quy định sử dụng vaccine tạm thời của Bộ NN0 & PTNT.
- Xác định đáp ứng miễn dịch và độ dài miễn dịch của gà, vịt được tiêm vaccine phòng bệnh cúm gia cầm H5N1.
- Giám sát virus học các đàn gà, vịt được tiêm vaccine.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
- Phương pháp thu thập số liệu, điều tra hiện trạng, lấy mẫu ngẫu nhiên, khách quan, trung thực.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.v
phòng thực hiện theo quy trình của nhà sản xuất vaccine.
- Xác định hiệu giá kháng thể và độ dài miễn dịch của gà, vịt được tiêm vaccine bằng phản ứng HI.
- Giám định virus cúm gia cầm chủng H5N1 bằng phản ứng RT-PCR. - Xử lý số liệu bằng phương pháp thống kê sinh học trên Excel.
*Giám định virus phân lập bằng phản ứng ngăn trở ngƣng kết hồng cầu HI:
- Pha kháng nguyên 4HA/25 µl: Lấy độ pha loãng cuối cùng có phản ứng ngưng kết hồng cầu nhân với 4.
- Tiến hành phản ứng HI: Trên 1 đĩa chữ V (96 giếng) có thể tiến hành phản ứng HI với nhiều kháng huyết thanh của các subtyp khác nhau.
+ Nhỏ 25 µl PBS vào các giếng của đĩa.
+ Nhỏ tiếp 25 µl kháng huyết thanh vào giếng đầu tiên.
+ Pha loãng kháng huyết thanh theo cơ số 2, bằng cách chuyển 25 µl kháng huyết thanh từ giếng 1 sang giếng 2 và tuần tự đến giếng 12 và bỏ đi 25 µl cuối cùng.
+ Nhỏ 25 µl kháng nguyên 4HA đã chuẩn bị vào các giếng từ giếng 2 đến giếng 12. Thêm 25 µl PBS vào hàng đối chứng hồng cầu (giếng1).
+ Lắc đĩa và để ở nhiệt độ phòng 20 - 30 phút.
+ Nhỏ 25 µl dung dịch hồng cầu (1%) vào tất cả các giếng của đĩa. + Lắc đều để đĩa ở nhiệt độ phòng 40 phút sau đó đọc kết quả.
- Đọc kết quả: Hồng cầu lắng xuống đáy cho kết quả phản ứng dương tính. Tức là, virus phân lập và kháng huyết thanh chuẩn tương ứng với nhau.
Theo quy định 1361/KTY - DT ngày 02/12/2005 của Bộ NN0& PTNT:
Ngưỡng bảo hộ có hiệu giá (HI) = 4log2. Kháng thể cao có hiệu giá (HI) > 4log2. Không được bảo hộ có hiệu giá (HI) < 4log2
* Phƣơng pháp phân lập virus cúm trên trứng gà có phôi:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.v
- Dịch ngoáy ổ nhớp, họng, khí quản:
+ Lắc mạnh ống chứa tăm bông dịch ngoáy bằng máy lắc Vortexmixer.
+ Bỏ tăm bông ra khỏi ống dịch ngoáy.
+ Bổ sung 1/10 lượng kháng sinh đậm đặc, lắc đều. + Để mẫu lắng cặn khoảng 30 phút ở nhiệt độ phòng.
+ Bổ sung 1/10 lượng kháng sinh đậm đặc, chuyển sang ống ly tâm. Ly tâm với tốc độ 400g (2.000 vòng /phút) trong 10 phút.
+ Thu dịch nổi.
Tiến hành phân lập: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Chọn trứng có phôi 9 - 10 ngày tuổi khoẻ mạnh, 3 trứng /bệnh phẩm. - Lau trứng bằng cồn 70% và đục lỗ nhỏ phía trên buồng hơi.
- Dùng seringe 1 ml lắp kim và hút dịch bệnh phẩm (đã xử lý ở trên) tiêm vào xoang niệu mô với lượng 0,2 ml/trứng.
- Gắn vết tiêm bằng keo dán.
- Ấp trứng tiếp 2 - 3 ngày ở nhiệt độ 370C.
- Theo dõi sau khi tiêm, soi trứng ngày 2 lần. Những trứng chết được cất vào tủ lạnh 40C để kiểm tra.
Thu hoạch nước trứng sau khi phân lập:
- Ấp trứng chết hoặc sống được cất vào tủ lạnh 40C qua đêm hoặc ít nhất 4 giờ trước khi thu hoạch.
- Lau trứng bằng cồn 70%.
- Dùng kéo vô trùng cắt vỏ trứng, bộc lộ buồng hơi, gạt màng xoang niệu mô sang bên.
- Thu dịch niệu mô vào ống nghiệm (thu hoạch riêng trứng sống và chết). - Mẫu đã phân lập được kiểm tra bằng phản ứng HA.
* Phản ứng Real time RT - PCR:
Nguyên liệu:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.v
- ARN đối chứng dương tính M, H5 và H7. - Cồn tuyệt đối.
- Isopropanol 99% tinh khiết. - Chloroform 99% tinh khiết.
- Trizol LS reagent (Invitrogen, cat #10296 - 010 hoặc 10296 - 028). - Kit chiết tách Qiagen Rneasy Extraction (cat # 74104 50 prep hoặc #74106 250 prep).
- Kit RT - PCR 1 bước Qiagen (cat # 210210 hoặc 210212) hoặc Superscript RT - PCR One - Step RT - PCR với Platinium Taq ADN Polymerase (cat 10928 - 034 hoặc 10928 - 042, Invitrogen).
- Mẫu dò và primer.
Bảng 1. Trình tự chuỗi của mẫu dò và Primer cho RTRT – PCR phát hiện cúm gia cầm
Đặc hiệu Ký hiệu Trình tự chuỗi
M (cho bất
kỳ cúm A)
M + 25*
5’- AgA TgA gTC TTC TAA CCg Agg TCg - 3’ 5’ Primer
M + 64*
5’- FAM - TCA ggC CCC CTC AAA gCC gA - TAMRA - 3’ Mẫu dò
M - 124* 5’- TgC AAA AAC ATC TTC Aag TCT CTg - 3’
3’Primer
H7
(BắcMỹ) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
H7+ 1244* 5’- ATT ggA CAC gAg ACg CAA Tg - 3’
5’ Primer H7 + 1281*
5’- FAM - TAA TgC TgA gCT gTT ggT ggC - TAMRA - 3’ Mẫu dò
H7 - 1342*
5’- TTC TgA gTC CgC AAg ATC TAT Tg - 3’ 3’Primer
H5
H5 + 1456*
5’- ACg TAT gAC TAT CCA CAA TAC TCA - 3’ 5’ Primer
H5 + 1637*
5’- FAM - TCA ACA gTg gCg AgT TCC CTA gCA -TAMRA - 3’ Mẫu dò
H5 - 1685* 5’- AgA CCA gCT ACC ATg ATT gC - 3’ 3’Primer
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.v
- Rnase Inhibitor, 40 unit/µl (Promega, cat # N2511 hoặc N2515). - MgCl2, 25µM (Promega, cat # A3511 hoặc A3513).
- Đệm TE pH 8.0, 1X, (Promega # V6231 hoặc V6232). - 14.3 M *β - mercaptoethanol (β - ME) (Sigma M6250).
- Hoạt chất phản ứng M và H5 cho AIV RRT - PCR đã được chuẩn bị bởi Cepheid để sử dụng cho các xét nghiệm M và H5. Mỗi hoạt chất phản ứng đủ cho 4 phản ứng loại 25µl. Mỗi giọt chứa primer và mẫu dò đặc hiệu, KCl, MgCl2, và đệm HEPES. Thêm vào đó giọt M gồm cả chất điều khiển trong (IC). Mục đích của IC là phát hiện một âm tính giả tạo ra từ các chất ức chế không đặc hiệu của quá trình phân gen.
- Chất điều khiển trong M là một ARN chuỗi đơn phiên mã dài 228 base. Nó chứa chuỗi bổ sung với primer tiến ở đầu 5’ và primer lùi ở đầu 3’ và một chuỗi bên trong (internal) để gắn với mẫu dò IC. Hạt M gồm có một mẫu dò đánh dấu F để phát hiện gen M, và mẫu dò đánh dấu Cal - Flour Red 610 cho IC.
- Hạt chất phản ứng H5 gồm có 2 primer tiến, một để phát hiện AIV H5
dòng Bắc Mỹ và một để phát hiện AIV H5 dòng Âu - Á chất phản ứng H5, một mẫu dò H5 đánh dấu FAM phát hiện được cả 2 dòng. Chất phản ứng được chia vào các ống 0,5µl có thể sử dụng để hoàn nguyên. Chất phản ứng được sử dụng với dNTP và enzyme của kit Qiagen RT - PCR onestep. Chất phản ứng có thể bảo quản trong túi thiếc ở 40
C trong 6 tháng không cởi bỏ túi nếu chưa sử dụng.
* Các bƣớc tiến hành :
Trước khi làm RTRT - PCR, đặt các pipet, khay, đầu pipet,... vào buồng vô trùng sạch. Tương tự, đặt các dụng cụ làm mẫu vào buồng vô trùng khác. Bật đèn tử ngoại trong nhiều giờ hoặc qua đêm để giảm tạp nhiễm ARN từ pipet và các dụng cụ khác.
- Chiết tách ARN từ mẫu dịch ngoáy (phương pháp Qiagen RNeasy) :
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.v
lượng 500 µl sang ống ly tâm nhỏ và ghi ký hiệu mẫu.
+ Cho 500 µl Qiagenđ buffer RLT có β - ME vào ống ly tâm trên. Lắc đều trên máy Votex.
+ Ly tâm (bằng máy Spindown) để dịch bệnh phẩm đọng trên nắp trôi xuống đáy ống. Cho 500 µl cồn ethanol 70%, lắc mạnh bằng Votex. Ly tâm lấy mẫu đã bị dung dải trong vòng 5 phút với tốc độ 5000 vòng ở nhiệt độ phòng.
+ Chuyển tất cả dịch nổi chứa mẫu bị dung dải sang cột RNeasy Qiagen đã ghi sẵn kí hiệu mẫu. Ly tâm trong vòng 15 giây tốc độ ≥ 8000 g ở nhiệt độ phòng. Kiểm tra dịch mẫu đã thấm qua cột lọc chưa, lặp lại bước này cho đến khi toàn bộ mẫu đã qua cột lọc.
+ Bổ sung 700 µl dung dịch rửa 1 (RW1 buffer) vào cột RNeasy Qiagen, ly tâm trong 15 giây ở tốc độ ≥ 8000 g, thay ống thu mẫu mới (collection tube) vào cột lọc.
+ Cho 500 µl RPE buffer vào cột RNeasy và ly tâm trong 15 giây ở tốc độ ≥ 8000 vòng, thay ống thu mẫu mới vào cột lọc.
+ Lặp lại bước trên 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer. Sau lần rửa cuối cùng thay ống thu mẫu mới loại 2µl vào cột lọc. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Ly tâm cột lọc trống không trong 2 phút ở tốc độ tối đa (khoảng 12.000 vòng /phút), bỏ ống thu mẫu.
+ Đặt cột lọc vào ống thu hoạch đã được ghi sẵn ký hiệu mẫu. Cho 50 µl RNase free H2O vào cột lọc. Chú ý không được chạm đầu pipet vào mặt thạch Silica trong cột lọc, ủ ở nhiệt độ phòng trong ít nhất 1 phút. Tách ARN bằng cách ly tâm cột trong 1 phút ở 10.000 vòng /phút. Bỏ cột lọc RNeasy.
+ Bảo quản mẫu ARN thu được ở 40C trong thời gian ngắn trước khi làm RTRT - PCR, nếu sau 24 giờ, mẫu nên bảo quản ở - 200C hoặc nhiệt độ thấp hơn.
- Chiết tách mẫu tổ chức bằng Trizol LS :
+ Cho 0,75 ml Trizol LS reagent (hoặc 1ml Trizol reagent) và 0,25 ml dịch bệnh phẩm (0,1 ml dịch bệnh phẩm nếu dùng Trizol reagent)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.v
vào ống 1,5 ml. lắc đều và để ở nhiệt độ phòng 5 phút.
+ Thêm 0,2 ml chloroform vào mỗi ống. Lắc mạnh trong 15 giây và để ở nhiệt độ phòng 5 phút.
+ Ly tâm ống ở nhiệt độ 12.000g trong 15 phút ở 40
C.
+ Chuyển phần nước (khoảng 500 µl) sang ống microtube mới. +Thêm 0,5 ml Isopropanol và lắc đều. Để 5 - 10 phút ở nhiệt độ phòng. + Ly tâm ống ở tốc độ 10.000 vòng trong 5 phút ở 40C, bỏ dung dịch trong ống đi.
+ Rửa ARN đọng ở đáy ống bằng cồn 80%, lắc mạnh và ly tâm với tốc độ 10.000 vòng trong 5 phút ở 40
C.
+ Bỏ dung dịch trong ống và làm khô ARN 10 phút ở nhiệt độ phòng và hoà tan lại với 30 µl nước cất không có RNase hoặc nước cất đã xử lý DEPC.
- Sao mã ngược và PCR :
+ Trong buồng vô trùng sạch, chuẩn bị hỗn hợp nhân gen (master mix) với các thành phần sau đủ dùng cho số lượng mẫu cần xét nghiệm.
+ Quy trình này được áp dụng cho máy nhân gen Cepheid Smart Cycler (Cephied, Sunnyvale, CA).
+ Thông tin về khởi động và cài đặt chương trình cho máy Smart Cycler có trong quyển hướng dẫn của hãng. Chế độ chạy RT - PCR cho máy Smart Cycler được hướng dẫn trong bảng 2 và 3.
Bảng 2. Chu kỳ nhiệt của bƣớc phiên mã ngƣợc (RT) dùng cho Quiagen one step RT - PCR kit
Bƣớc phiên mã ngƣợc Thời gian (phút)
Nhiệt độ (0C)
Một chu kỳ 30 50
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.v
Bảng 3. Chu kỳ nhiệt cho tổng hợp gen và các cặp mồi
Cặp mồi Chu kỳ Bƣớc Thời gian
(giây)
Nhiệt độ (0C)
AIV matrix 45 Biến tính 1 94
H7 40 Bám của cặp mồi 20 60 Biến tính 1 94 Bám của cặp mồi 20 58 H5 40 Biến tính 1 94 Bám của cặp mồi 20 57
Kéo dài chuỗi tổng hợp 5 72 (Chú ý: Màu huỳnh quang được xác định ở bước bám gắn của cặp mồi). Phản ứng RTRT - PCR được tiến hành với những thành phần sau cùng với cặp mồi và chu kỳ thích hợp. Khởi động phản ứng với các ống phản ứng được đặt trong giá đựng ống lạnh và dùng các đầu pipet có lọc. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Các bước tiến hành phản ứng PCR :
Bước 1: Trộn dung dịch Master mix (MM) tùy theo lượng mẫu thí nghiệm. Số lượng thành phần dung dịch MM trên một mẫu bệnh phẩm là :
Rw (nước tinh khiết): 5,5 µl. 2X (nguyên liệu): 12,5 µl.
PPP (probe, primer xuôi và ngược): 1,5 µl. E (enzyme): 0,5 µl.
Bước 2: - Trộn 20 µl hỗn hợp MM với 5 µl mẫu thí nghiệm, lắc đều bằng máy rung Votex.
- Cho 25 µl mẫu đối chứng vào ống đối chứng dương. Cho 25 µl nước cất vào ống đối chứng âm.
Bước 3: Đặt ống phản ứng vào máy chu kỳ nhiệt và chọn chương trình chạy PCR, bắt đầu chạy, nhập ký hiệu mẫu kiểm tra cùng với mẫu đối chứng dương tính, âm tính vào phần cuối ký hiệu mẫu trong bảng kết quả. Lưu chương trình chạy máy. Sau 1 tiếng 30 phút đọc kết quả.
- Phân tích kết quả xét nghiệm :
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.v
dương tính ARN đã sao mã được pha loãng ở hàm lượng sử dụng cho giá trị Ct khoảng 25. Khi đối chứng dương có Ct cao hơn 29 thì phải làm lại để xét nghiệm đảm bảo. Nếu Ct của đối chứng dương tính thấp hơn 20, nên pha chuẩn độ lại độ pha loãng của đối chứng. Bất kỳ thời điểm nào Ct của đối chứng dương tính hoặc đường cong tăng trưởng khác thấp hơn 14, giá trị trừ nền có thể bị sai lệch.
+ Giám định các mẫu dương tính yếu: Loại bỏ tất cả phản ứng lớn hơn 100 đơn vị tăng huỳnh quang từ trong đồ thị (điều này làm thay đổi thước đo để dễ xác định các trường hợp dương tính yếu. Quan sát riêng từng mẫu sẽ giúp cho phát hiện các phản ứng dương tính yếu.
+ Những mẫu có Ct bằng 35 hoặc lớn hơn được xem là dương tính nghi ngờ và được xét nghiệm lại.
Hình 2.1: Kết quả đọc bằng máy Cepheid® Smart Cycler 2.4. Đối tƣợng, thời gian, địa điểm nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu là gà, vịt.
- Thời gian nghiên cứu từ tháng 08/2009 đến tháng 08/2010.
- Địa điểm nghiên cứu trên địa bàn tỉnh Hà Tây cũ và Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung Ương.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.v
Chƣơng III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tình hình chăn nuôi gia cầm, diễn biến dịch cúm gia cầm và kết quả phòng chống dịch của tỉnh Hà Tây cũ một số năm vừa qua
3.1.1. Tình hình chăn nuôi gia cầm của tỉnh Hà Tây cũ một số năm vừa qua
Hà Tây cũ, nay thuộc thành phố Hà Nội nằm trong vùng đồng bằng châu thổ Sông Hồng, được chia thành 14 đơn vị hành chính trong đó có 2 thị xã và 12 huyện. Tỉnh có địa hình phong phú và đa dạng, phía Đông giáp trung tâm thủ đô Hà Nội (trước khi Hà Tây thuộc Hà Nội), phía Tây giáp Hòa Bình, phía Nam giáp Hà Nam, phía Bắc giáp Vĩnh Phúc và Phú Thọ cùng với hệ thống giao thông phát triển đã thúc đẩy quá trình giao lưu, buôn bán, trao đổi hàng hóa, sản phẩm của tỉnh với các tỉnh thành lân cận cũng như thông thương trong cả nước.
Có những điều kiện thuận lợi về địa hình, giao thông vận tải và khí hậu nên tỉnh đã trở thành nơi tập trung đầu tư, phát triển chăn nuôi trang trại với quy mô lớn của các trung tâm, các tập đoàn liên doanh sản xuất thức ăn gia súc và con giống lớn như: công ty C.P Việt Nam (Thailand), công ty Japfa Comfeed Việt Nam (Indonesia), công ty liên doanh Proconco (France). Bên cạnh đó, chăn nuôi đã găn liền với phong tục, tập quán của người dân nơi đây