1.6.2.1. Kính hiển vi phản gơng (HVPG).
Hiện tợng ánh sáng phản chiếu cho phép quan sát hình ảnh nội mô giác mạc. Từ những năm đầu thế kỷ 20, Gullstrand (1911) và Vogt (1920) đã áp dụng hiện tợng này để quan sát nội mô bằng đèn khe. Tuy nhiên kỹ thuật soi phản chiếu bằng đèn khe khó chụp ảnh và độ phóng đại không cao, hơn nữa phơng pháp này chỉ mang tính chất định tính.
Cho tới năm 1968, David Maurice đã đa ra kính hiển vi phản gơng đầu tiên dùng trong lâm sàng.
- Nguyên lý hoạt động:
Một chùm ánh sáng để tới đợc lớp nội mô giác mạc phải đi xuyên qua tất cả các lớp trớc của GM và các mặt phân cách từ phim nớc mắt tới nội mô, đợc truyền qua hoặc hấp thụ một phần tuỳ thuộc vào bớc sóng ánh sáng tới, mức độ trong suốt của GM, đợc phản xạ theo quy luật góc phản xạ bằng góc tới, đ- ợc khúc xạ một phần khi qua các mặt phân cách giữa các môi trờng khác nhau. Phần ánh sáng phản xạ thu đợc sẽ tổng hợp nên hình ảnh nội mô GM [70], [72].
- Chất lợng hình ảnh nội mô phụ thuộc vào độ rộng của chùm tia tới, độ trong của giác mạc, sự đều đặn của các mặt phân cách (giữa phim nớc mắt - biểu mô - lớp Bowmann - nhu mô - Descemet - nội mô - thuỷ dịch). Khi độ rộng của chùm tới quá lớn, khi giác mạc đục hoặc bề mặt của các mặt phân cách không đều (do viêm, phù...) sẽ làm các tia phản xạ của ánh sáng tới qua các bề mặt phân cách bị phân tán, hình ảnh nội mô bị nhiễu, thậm chí không thu đợc.
Từ những phát minh đầu tiên của Maurice, Brown (1970-1974) đã phát minh máy hiển vi phản gơng không tiếp xúc đầu tiên. Laing và Sandstrom, tiếp theo là Leibowitz và Kauffman đã cải thiện hình ảnh bằng cách mở rộng trờng quan sát nhờ sử dụng nguyên lý tổng của các tia phản xạ kề nhau [19], [38].
Việc quan sát nội mô trong lâm sàng bằng hiển vi phản gơng có sử dụng máy chụp ảnh đợc đa ra bởi Laing (1973), kèm theo một vật kính nhằm loại trừ những phản xạ không mong muốn phát ra từ tia tới và từ chính tia phản xạ.
Koester (1979) [34] , [48] đã phát minh ra bộ phận quang học quét bằng cách sử dụng lăng kính xoay, do đó gộp đợc hình ảnh nội mô của các vùng giác mạc kề nhau, làm mở rộng trờng quan sát, đánh giá đợc một số lợng lớn tế bào, đồng thời sử dụng hệ thống video để vừa tránh dùng kính tiếp xúc vừa thực hiện việc ghi lại hình ảnh một cách dễ dàng.
Gần đây, việc áp dụng hiển vi phản gơng trờng rộng ngày càng phổ biến, có thể tiếp xúc với giác mạc hoặc không. Loại tiếp xúc có chứa một dụng cụ hình chóp mà đầu phẳng tiếp xúc trực tiếp trên giác mạc. Loại không tiếp xúc dùng dụng cụ hình chóp không tiếp xúc với GM để loại trừ nguy cơ viêm nhiễm, sang chấn, nhất là với những mắt sau phẫu thuật.
Chùm tia tới rơi trên giác mạc xuyên qua thấu kính hình chóp vào mặt phân cách nội mô - thuỷ dịch rồi phản xạ trở lại, đi qua thấu kính chóp để tới
camera ở tiêu cự phù hợp. ảnh chụp từ HVPG đợc chọn trên nền sáng với độ phóng đại 400 lần, 50 - 100 tế bào liên tiếp đợc đếm để phân tích và hạn chế sai số, các thông tin thu đợc sẽ đợc phân tích qua phần mềm của máy tính [28] [70].
Kính hiển vi phản gơng cho phép đánh giá số lợng và chất lợng tế bào nội mô. Số lợng thể hiện bởi mật độ tế bào, chất lợng thể hiện bởi biến đổi hình dạng và kích thớc tế bào. Một số kính hiển vi phản gơng có thể còn đợc gắn thiết bị đo chiều dày GM [18], [39], [Error: Reference source not found], [Error: Reference source not found].
- Có 2 phơng pháp phân tích hình ảnh nội mô chụp đợc từ máy HVPG: + Khung phân tích cố định (tĩnh): Đếm số TB trong 1 khung diện tích hằng định, tính toàn bộ những TB nằm trọn trong khung, các TB nằm trên 2 cạnh kề nhau của khung đợc tính bằng 1 nửa số lợng, không kể đến phần diện tích mà các TB đó bị chia bởi cạnh của khung.
Mật độ TB = số TB/diện tích của khung.
Diện tích khung = Diện tích thật sự của khung/(Độ phóng đại của máy)2. Diện tích trung bình TB = Diện tích khung/số TB.
Trên thực tế, cần đếm ít nhất 35 TB liên tục (tốt nhất là 50-100 TB).
+ Khung phân tích không cố định (động): Đánh dấu 1 số nhất định các tế bào nguyên vẹn liên tục, đo diện tích của vùng đợc đánh dấu. Phơng pháp này tính đợc chính xác giới hạn của TB nên cho ít sai số hơn, đồng thời còn cung cấp thông tin chính xác về hình thể TB mà phơng pháp phân tích tĩnh không tính đợc.
- Những hình ảnh thu đợc từ máy HVPG [57], [Error: Reference source not found]:
+ Cấu tạo tế bào: Dạng khảm gần nh đều đặn, rõ bờ , kích thớc 100 -400 μm2, góc gian bào khoảng 60°.
+ Viền TB và đờng giao nhau của chúng: Viền TB xuất hiện trên ảnh nội mô là những đờng tối do ánh sáng tới bị phân tán ở viền TB và không phản xạ trở lại bộ phận quang học của máy. Hầu nh các đờng viền xuất hiện nh các đ- ờng thẳng mảnh, chúng giao nhau tạo nên góc 60°. Khi góc giữa các đờng viền thay đổi so với giá trị này gợi ý có bất thờng về hình dạng tế bào.
Có 4 kiểu hình ảnh cơ bản của đờng viền TB: thẳng, lôì, gồ ghề, lợn sóng hoặc có thể phối hợp hình ảnh giữa chúng.
+ Cấu trúc trong TB:
Cấu trúc sáng, kích thớc không đồng đều trong 1 hoặc nhiều TB thờng thấy ở các TB bị giãn rộng hoặc bị kéo căng.
Cấu trúc sáng, màu trắng, lấp lánh, tơng ứng với tủa sắc tố trên nội mô. Có thể xuất hiện 2 cấu trúc tối trong TB: 1 loại nhỏ, ở trung tâm hoặc cạnh trung tâm, là nền nội mô của thể mi, 1 loại lớn hơn, tách biệt với bờ ngoài, là bọng giữa các TB.
+ Cấu trúc giữa các TB: tối, kích thớc đồng nhất, nằm ở gian bào ở BN có viêm MBĐ trớc, các giọt lắng đọng trên nội mô có thể to hoặc nhỏ hơn 1 TB nội mô.
- Các trờng hợp cần ghi lại hình ảnh nội mô bằng hiển vi phản gơng bao gồm [71]:
+ Chấn thơng đụng dập, đặc biệt khi có xuất huyết tiền phòng. + Glôcôm góc đóng.
+ Viêm bán phần trớc.
+ Hội chứng Chandler: phù GM 1 mắt, số lợng TB bình thờng nhng có rối loạn về hình dạng, có đờng ranh giới với GM lành.
+ Các bất thờng nghĩ đến loạn dỡng nội mô di truyền. + Đánh giá, theo dõi nội mô sau PT ghép GM xuyên. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Kiểm tra nội mô ở mắt đã lấy TTT, mắt có TTT nhân tạo tiền phòng, mắt đeo kính tiếp xúc kéo dài.
+ Kiểm tra nội mô trớc các PT bán phần trớc nhãn cầu.
- Kính hiển vi phản gơng cho phép đánh giá tình trạng nội mô về số lợng và chất lợng, góp phần đa ra chỉ định cách thức và thời điểm phẫu thuật, nhất là với những mắt có tổn thơng nội mô sẵn có, đánh giá và theo dõi biến đổi tế bào nội mô sau PT để có quyết định can thiệp kịp thời nếu cần.
1.6.2.2. Kính hiển vi quét đồng tiêu cự [16].
Là một dụng cụ có khả năng phân giải và khả năng cắt quang học cao hơn so với kính hiển vi phản gơng. Kính hiển vi này có thể dùng để nghiên cứu tất cả các lớp tế bào của giác mạc, kể cả trờng hợp phù nề và sẹo đục. Nó gồm một hình chóp dẹt tơng tự của hiển vi phản gơng gắn vào kính hiển vi cho phép quét bằng cách di chuyển tiêu bản qua một điểm chiếu sáng cố định. Hình ảnh đợc truyền qua hệ thống video tới một bộ tăng cờng và phân tích hình bằng máy tính.