3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.4.6.Kết quả tách plasmid tái tổ hợp
Chọn khuẩn lạc trắng tƣơng ứng với 2 mẫu nghiên cứu có sản phẩm colony - PCR ở trên tách plasmid tái tổ hợp theo bộ kít của hãng Bioneer. Sản phẩm DNA plasmid tái tổ hợp đƣợc điện di trên gel agarose 1% trong TAE 1X. Kết quả điện di tách plasmid đƣợc thể hiện ở hình 3.10.
1 2
Hình 3.10. Hình ảnh điện di tách plasmid tái tổ hợp
1. Plasmid mang gen cystatin của giống LVN885 2. Plasmid mang gen cystatin của giống C919
Kết quả điện di trên hình 3.10 cho thấy, sản phẩm tách plasmid sạch, đảm bảo chất lƣợng và số lƣợng để tiến hành đọc trình tự nucleotide của gen cystatin.
3.5. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN CYSTATIN
Để xác định trình tƣ̣ nucleotide của gen cystatin đã tách dòng, chúng tôi gửi đọc trình tƣ̣ nucleotide của gen cystatin trên thiết bị giải trình tƣ̣ tƣ̣ động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer tại viện Công nghệ Sinh học. Kết quả đƣợc phân tích bằng phần mềm BioEdit.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
49
Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen cystatin của giống ngô LVN885 với gen cystatin D38130 trên Ngân hàng gen NCBI đƣợc trình bày ở hình 3.11.
Kết quả cho thấy kích thƣớc của gen cystatin ở giống ngô LVN885 và D38130 trên Ngân hàng gen NCBI có kích thƣớc 405 nucleotide. Chúng tôi kết luận đã khuếch đại, tách dòng, giải trình tự nucleotide thành công đoạn gen của giống LVN885. So sánh trình tự nucleotide của gen cystatin ở giống ngô LVN885 và D38130 trên Ngân hàng gen cho thấy, hai trình tự này chỉ khác nhau ở 3 vị trí là 354, 355 và 362. Do vậy trình tự gen cystatin của giống ngô LVN885 và D38130 có hệ số tƣơng đồng nucleotide cao là 99,2%.
Hình 3.11. So sánh trình tự nucleotide của gen cystatin ở LVN885 với D38130
Việc nghiên cứu một gen nào đó, ngoài trình tự nucleotide ngƣời ta còn quan tâm đến trình tự amino acid trong phân tử protein là sản phẩm của gen đó. Trên cơ sở này bằng phần mềm BioEdit chúng tôi đã tiến hành so
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
50
sánh trình tự amio acid suy diễn từ gen cystatin của giống ngô LVN885 với D38130 trên Ngân hàng gen kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.12.
Hình 3.12. So sánh trình tự amino acid của giống ngô LVN885 với D38130
Kết quả ở hình 3.12 cho thấy, trình tự amino acid trong protein cystatin ở giống ngô LVN885 với D38130 có sự khác nhau ở các vị trí là 118, 119, và 121. Sự tƣơng đồng của giống ngô LVN885 so với D38130 về trình tự amino acid là 97,7%.
Nhƣ vậy, trình tự gen cystatin của giống ngô LVN885 mà chúng tôi phân lập đƣợc có sự tƣơng đồng cao so với gen cystatin của giống ngô đã đăng ký trên Ngân hàng gen với mã số D38130. Để tiếp tục phục vụ cho việc tạo cây chuyển gen và xác định chỉ thị phân tử thông qua gen cystatin, chúng tôi sẽ tiếp tục nghiên cứu xác định trình tự gen của 1 số giống ngô khác có khả năng chịu hạn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
51
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận
1. Khả năng chịu hạn của các giống ngô có sự khác nhau, giống C919 là giống chịu hạn tốt nhất, giống LVN885 là giống chịu hạn kém nhất. 2. Giống C919 có hoạt tính của α – amylase cao nhất (18 mm), giống
LVN885 có hoạt tính của α – amylase yếu nhất (11 mm). Giống C919 có hoạt tính của protease mạnh nhất (17 mm), giống LVN885 có hoạt tính protease yếu nhất (12mm). Chiều dài rễ ở giai đoạn cây non sau 9 ngày gây hạn có kích thƣớc dao động từ 18,73 cm (LVN885) – 30,80 cm (C919). Có sự liên quan giữa khả năng chịu hạn với enzyme α – amylase, protease và chiều dài rễ.
3. Đã khuếch đại, chọn dòng và tách plasmid mang gen Cystatin ở một giống ngô chịu hạn tốt (C919) và một giống ngô chịu hạn kém (LVN885).
4. Đã xác định trình tự gen cystatin của giống ngô: LVN885 là giống chịu hạn kém nhất.
Đề nghị
Tiếp tục xác định thêm trình tự gen cystatin của các giống ngô khác để có cơ sở so sánh và xác định chính xác chỉ thị phân tử liên quan tới tính chống chịu.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
52 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen và chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội. 2. Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tƣờng (1998),
Thực hành hóa sinh học, NXB Giáo Dục.
3. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lƣơng, Đoàn Xuân Mƣợi, Phạm Văn Ty (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 3, NXB Khoa Học và Kỹ Thuật, Hà Nội.
4. Trƣơng Đích (2000), Kỹ thuật trồng ngô năng suất cao, NXB Nông nghiệp Hà Nội.
5. Nguyễn Xuân Hiển (1972), Một số kết quả nghiên cứu về cây ngô,
NXB Khoa Học và Kỹ Thuật, Hà Nội.
6. Trần Thị Phƣơng Liên (2005), “Phân lập gen dehydrin của ngô”, Tạp chí Công nghệ Sinh học,3(3), tr: 347-352.
7. Trần Thị Phƣơng Liên (2010), Protein và tính chống chịu ở thực vật, NXB Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội.
8. Nguyễn Đức Lƣơng, Dƣơng Văn Sơn, Lƣơng Văn Hinh (2000), Giáo trình cây ngô, NXB Nông ngiệp, tr:14-32.
9. Lê Đình Lƣơng, Dƣơng Văn Sơn, Lƣơng Văn Hinh (2002), Giáo trình cây lương thực (dành cho sinh viên cao học), NXB Nông nghiệp.
10. Chu Văn Mẫn, Ứng dụng tin trong sinh học (2003), NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội, tr: 53-163.
11. Chu Hoàng Mậu, Ngô Việt Anh (2005), “Đánh giá chất lƣợng hạt và khả năng phản ứng đối với hạn của một số giống ngô miền núi”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn 66, tr: 20-22.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
53
12. Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Thúy Hƣờng, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Hà (2011), Gen và đặc tính chịu hạn của cây đậu tương, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội.
13. Nguyễn Văn Mùi (2002), Xác định hoạt độ enzyme, NXB Khoa Học và Kỹ Thuật, Hà Nội.
14. Phạm Thị Thanh Nhàn (2007), Nghiên cứu đặc tính chịu hạn và môi trường nuôi cấy in vitro của một số giống ngô địa phương miền núi, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên.
15. Vũ Thị Thu Thủy (2011), Tạo dòng chịu hạn và phân lập gen Cystatin liên quan đến tính chịu hạn ở cây lạc, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên.
16. Nguyễn Thị Thu Trang (2008), Đánh giá chất lượng hạt, khả năng chịu hạn và phân lập gen Cystatin ở một số giống đậu xanh, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái nguyên. 17. Dƣơng Văn Sơn (1996), Nghiên cứu một số vật liệu ngô chịu hạn nhập
nội sử dụng trong sông tác chọn tạo giống, Luận án PTS Khoa học Nông nghiệp.
18. Phan Thị Vân, Ngô Hữu Tình, Luân Thị Đẹp (2005), “Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn của các dòng và các tổ hợp ngô lai luân giao ở giai đoạn cây con bằng phƣơng pháp gây hạn nhân tạo”, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn 2/2005.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
54
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
19. Abe K., Emori Y., Kondo H.,Susuki K., Aria S., (1987) “Molecular cloning of a cystein proteinase inhibitor of rice (Oryzacystatin) - Homology with animal cystatin and transient expression in the ripening process of rice seeds”, J Biol Chem, 262(35), pp: 16793-16797.
20.Abe M., Arai S., (1991), "Some propeties of a cystein proteinase inhibitor from corn endosperm", Agricultural and biological chemistry, 55(9), pp: 2417-2418.
21.Abrahanson M., Ritonja A., Brown M.A., Grabb A., Machleibt W., Barrett A.J., (1987), "Identification of the probable inhibitory reactive sites of the cysteine proteinase inhibitors, Human cystatin c and chicken cystatin", J. Biol, Chem, 262, pp: 9688-9494.
22. Barrett A.J., (1986), “The Cystatins: a diverse superfamily of cystein peptidase inhibitor”, Biomed Biochim Acta, 45, pp: 1363-1374.
23. Barrett AJ, Fritz H, Grubb A, Isemura S, Jarvinen M, Katunuma N, Machleidt W, Muller-Esterl W, Sasaki M, Turk V, (1986), "Nomenclature and classification of the proteins homologous with the cystein–proteinase inhibitor chicken cystein", Biochem J, 1, pp: 236- 312. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
24. Bray Elizabeth A., (1993), “Molecular responses to water deficit”,
Plant Physiol 103, pp: 1035-1040.
25. Chou W.M., Shigaki J., Dammann C., Liu J.Q., Bhattachamy M.K., (2004), "Inhibition of pathogenesis-related genes in soybean plant biology", 6, pp: 664-672.
26. Close T.J, (1989), “Zea mays mRNA for dehydrin (dhn1 gene)”, Plant Mol Biol, 13(1), pp: 95-108.
27. Diop N.N., Kidric., Repellin A., Gareil M., d'Acry-Lameta A., Pham Thi A.T., Zuil- Fodil Y., (2004), “A mulicystatin is induced by drough-
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
55
stress in cowpea (Vigna unguiculata (L) Walp.) leaves”, FEBS Lett
577(3), pp: 50-545.
28. Gawel N.J., Jarret R.L., (1991), “A wodified CTAB DNA extraction procedure of Musa and Ipomoea”, Plant Mol Biol Rep, 9, pp: 262 – 266.
29. Grudkowska M., Zagdanska B, (2004), “Multifunctional role of plant cysteine proteinases, Acta Biochim Polonica, 51(3), pp: 609 - 624. 30. Hatano K, Kojima M, Tanokura M, Takahashi K, (1996), "Solution
structure of bromelain inhibitor IV from pineapple stem: structural similarity with Bowman-Birk trypsin/chymotrypsin inhibitor from soybean", Biochemistry, 35(17), pp: 5379-5384.
31. Fernandes K.V.S, Paolo A., Sabelli P.A., Barratt D.H.P., Richardson., Xavier-Filho J., Shewry P.R, (1993), "The resistance of cowpea seeds to bruchid beetle is not related to levels of cystein protease inhibitors",
Plant molercular biology, 23(1), pp: 215-219.
32. Kader J.C., (1996), “Lipid-transfer proteins in plant”, Annu Rev Plant Phys , 47.
33. Karen S. and John M., (1990), “Gene expression in respone to abscisic acid and osmotic stress”, Plant cell, 2.
34. Liu K.H., Lin T.Y., (2003), “Cloning and characterization of two novel lipid transfer protein I genes in Vigna radiate, DNA sequence”, J Seq Map, 14(6).
35. Machleidt W., Thiele U., Laber B., Arsfald, Machleidt I., Ester L., Wiegand G., Kos J., Turk V., Bode W., ( 1989), "Mechanism of inhibition of papain by chicken egg white cystatin: Inhibition constants of N-terminally truncated forms and cyano gen bromid fragments of the inhibitor.", Bio. Chem, 243(2), pp: 234-238.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
56
36. Martinez M., Abraham Z., Carbonero P., Diaz I., (2005), "Comparative phylogenetic analysis of cystatin gen families from arabidopsis, rice and barley", Mol genet genomic, 273(5), pp: 423-432. 37. Misaka T., Kuroda M.,Iwabuchi K., Abe K., Arai S., (1996),
"Soyacystatin, A novel cystein proteinase inhibitor in soybean, is distinct in protein structure and gene organization from other cystatins of animal and plant origin", European Journal of biochemistry, 240, pp: 609.
38. Monia A., Diaz I., Vasil I.K., Carbonero P., Garcia O.F, (1996)," Two cold-inducible genes encoding lipid transfer protein LTP 4 from barley show differential responses to bacterial pathogens", Molercular and general genetics, 252, pp: 163-168.
39. Massonneau A., Condamine P., (2005), Wisniewski J. P., Zivy M., Rogowsky P. M., “Maize cystatins respond to developmental cues, cold stress and drought”, Biochim Biophys Acta, 1729 (3) pp: 99-186.
40. Oliveira A.S., Filho J.X., Sales M.P., (2003) “Cysteine proteinases and cystatins”, Braz Arch Biol Techn, 46(1) pp: 91-104.
41. Ojima A., Shiota H., Higashi K., Shimma Y., Wada M.,Satoh S., (1997), "An extracularin soluble inhibitor of cysteine proteinase in cell cultrures and seed carrot", Plant molecular biology, 34, pp: 99-109. 42. Rawlings N.D, Barrett A.J., (1994), "Families of cysteine peptidases",
Methods enzymol, 244, pp: 461-486.
43. Ryan S.N., Mc Manus M.J., Laiing W.A, (2003), "Indentification and characterisation of proteinase inhibitor and their gen from seeds of apple (malus domestica)", Japanese Biochemical Society, 134(1), pp: 31-42.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
57 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
44.Turk B., Turk V., Turk D., (1997), "Structural and functional aspects of papain-like cysteine proteinase and their protein inhibitor", Biol. Chem. Hopp seyler, 378, pp: 141-150.
45.Trysellius Y., Huttmark D., (1997), "Cysteine proteinase 1, a chatepsin L-like enzyme expressed in the Drosophila melanogaster haemocyte cell line mbn-2", Insect molecular Biol, 6(2), pp: 173-181.
46. Xiong L., Karen S.S.,Zhu J.K, (2001)," Cell signaling during cold, drought, and salt stress", The plant cell, pp: 165-183.
47. Valdes R. S., Guerrero R. A., Melgoza V. C., Chagolla L. A., Delgado V.F., Martinez G. N., Sanchez H. N., Delano F. J., (2007), “Cloning of a cDNA encoding a cystatin from grain amaranth (Amaranthus hypochondriacus) showing a tissue-specific expression that is modified by germination and abiotic stress”, Plant Physiology and Biochemistry
45(10-11), pp: 8-790.
48.Wangxia W ., Basia V., Oded S., Arie A., (2004), "Role of plant heat shock protein and molecular chaperon in the abiotic stress responds",
Plant science, 9(5), pp: 244-252.
49.Walsh J.A., Strick land J.A., (1993), "Proteolysis of the 85-kilodalton crystaltine cysteine proteinase inhibitor from potato release funtional cystatin domains", Plant physiol, 103(4), pp: 1227-1234.
50.Waldron C., Wegrich L.M., Merlo P.A.O, Walsh J.A., (1993), "Characterization of a genemic sequence coding for potato multicystatin, An eight-domain cystein proteinase inhibitor", plant molecular biology 23(4), pp: 801-812.
51.YamamotoY., Takimoto K., Izumi S., Tonyamasakurai M., Kageyama T., Takahash S.Y., (1994), "Molecular cloning and sequencing of
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
58
cDNA that encodes cysteine proteinase in the egg of silkmoth, bombysmory", T. Biochem, 116, pp: 1330-1335.
52. Yang W., Jifeng Y., Minika K., Maryse C., Angela S., Charlene M., Tina U., Carlene S., Jiangxin W., David T.D., Peter M., Yafan H, (2005)," Molecular tailoring of faresy lation for plant drought tolerance and ield protection", The plant journal, 43, pp: 413-424.
53.Yin L., Lan Y., Zhu L., 2008, "Analysis of the protein expression profiling during rice callus differentiation under different plant hormone conditions", Plant mol biol, 68(6), pp: 597-617.
54. Zhang X., Liu S., Takano T., (2008), “Two cysteine proteinase inhibitors from Arabidopsis thaliana, AtCYSa and AtCYSb, increasing the salt, drought, oxidation and cold tolerance”, Plant Mol Biol, 68(1-2) , pp: 43-131. MỘT SỐ TRANG WEB 55.http: //www.ncbi.nlm.nih.gov./sites/nuccore/AF454396. 56.http: //www.ncbi.nlm.nih.gov./sites/nuccore/D63342. 57.http: //www.ncbi.nlm.nih.gov./sites/nuccore/D64115. 58.http: //www.faostat.fao.org
i
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh
người đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều điện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Khoa học-
Đại học Thái Nguyên, Viện Khoa học Sự sống- Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm Khoa Khoa học Sự sống, các thầy cô giáo và các cán bộ trong
Khoa đã ủng hộ, tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Lê Văn Sơn, KS Hồ Mạnh Tường và các
cán bộ Viện Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện giúp đỡ để tôi hoàn thành
luận văn.
Lời cảm ơn sau cùng tôi xin gửi tới gia đình, người thân, bạn bè đã
luôn động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học
tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Thái Nguyên, ngày 30 tháng 7 năm 2012 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tác giả luận văn
ii
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, sự giúp đỡ của các cán bộ Khoa Khoa học Sự Sống - Đại học Khoa học, Viện Khoa học Sự Sống - Đại học Thái Nguyên, Viện Công nghệ Sinh học. Các số liệu nêu trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ các công trình nào khác. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận văn này.
Thái Nguyên, ngày 30 tháng 7 năm 2012
Tác giả
iii
MỤC LỤC
Lời mở đầu ... i
Lời cam đoan ... ii
Mục lục ... iii
Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt ... v
Danh mục các hình trong luận văn ... vi
Danh mục các bảng trong luận văn ... vii
MỞ ĐẦU ... 1
1. ĐẶT VẤN ĐỀ ... 1
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU... 2
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ... 2
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ... 3
1.1. CÂY NGÔ ... 3
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại... 3
1.1.2. Đặc điểm sinh học ... 3
1.1.3. Giá trị kinh tế của cây ngô ... 5
1.1.4. Đặc điểm hóa sinh hạt ngô ... 6