3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp sinh lí, hóa sinh
2.3.1.1. Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn
Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn của 10 giống ngô lai ở giai đoạn cây non theo phƣơng pháp của Lê Trần Bình và đtg [1].
Hạt ngô đƣợc gieo vào các chậu trồng chứa cát vàng đã rửa sạch, mỗi chậu trồng 30 cây, 3 chậu cho mỗi giống, thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần với điều kiện và chế độ chăm sóc nhƣ nhau. Tƣới nƣớc cho đến khi cây có 3 lá thật. Sau khi cây có 3 lá thật tiến hành gây hạn nhân tạo bằng cách không tƣới nƣớc đến khi cây héo, trong quá trình gây hạn che không cho nƣớc mƣa vào chậu. Thời điểm tiến hành thí nghiệm đƣợc thực hiện vào mùa khô từ tháng 9 - 11 âm lịch. Khi cây non có 3 lá thật bắt đầu héo, tiến hành theo dõi mức độ héo của cây trong vòng 3, 5, 7, 9 ngày kể từ khi thí nghiệm bắt đầu có cây héo. Sau đó tƣới nƣớc trở lại và theo dõi khả năng phục hồi của cây sau 3, 5, 7, 9 ngày.
Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm: a: % cây không héo sau 3 ngày hạn; b: % cây phục hồi sau 3 ngày hạn; c: % cây không héo sau 5 ngày hạn; d: % cây phục hồi sau 5 ngày hạn; e: % cây không héo sau 7 ngày hạn; f: % cây phục hồi sau 7 ngày hạn; g: % cây không héo sau 9 ngày hạn; h: % cây phục hồi sau 9 ngày hạn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
28
Khả năng chịu hạn của các giống ngô đƣợc đánh giá bằng chỉ số chịu hạn tƣơng đối (S). Chỉ số chịu hạn tƣơng đối đƣợc xác định bằng đồ thị rada, gồm các trục a, b, c, d, e, f, g, h và mang các trị số tƣơng ứng mang các trị số tƣơng ứng an, bn, cn, dn, en, fn, gn, hn và chỉ số chịu hạn tƣơng đối đƣợc tính bằng đồ thị rada theo công thức:
Sn=
2
1sin α (an bn + bn cn + cn dn + dnen + en fn + fngn + gnhn + hn an)
Góc α đƣợc tạo bởi 2 trục mang trị số gần nhau; Sn: chỉ số chịu hạn tƣơng đối; n: ký hiệu các giống nghiên cứu.
2.3.1.2. Xác định hoạt tính enzyme α - amylase
Xác định hoạt tính của enzym α - amylase theo phƣơng pháp đục lỗ đƣợc mô tả theo tài liệu của Nguyễn Lân Dũng và đtg [3].
Nguyên tắc: dựa vào tính chất hòa tan của α - amylase trong dung dịch đệm phosphat (Na2HPO4, NaH2PO4) pH = 6,8.
Cách tiến hành: Cân 0,5 g mẫu bột ngô nghiền mịn, chiết bằng dung dịch đệm phosphat 0,2 M (pH = 6,8), ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4o C, thu dịch. Đổ đĩa thạch (thạch agar 2%, tinh bột 1%, H2O 100 ml), đổ vào đĩa petri 4 mm, để nguội, đục lỗ. Nhỏ 100 µl dịch chiết chứa enzyme vào mỗi lỗ, để tủ lạnh qua đêm để enzyme khuyếch tán, chuyển sang tủ ấm ở 30o C trong 24 giờ. Sau đó nhuộm lugol trong 5 phút và tráng bằng NaCl 1 N.
Hoạt tính enzyme đƣợc xác định theo kích thƣớc vòng phân giải: D - d (mm), trong đó D là đƣờng kính vòng phân giải, d là đƣờng kính lỗ.
2.3.1.3. Xác định hoạt tính protease
Hoạt tính protease đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đục lỗ theo tài liệu của Nguyễn Lân Dũng và đtg [3], [13].
` Cách tiến hành: cân 0,1g mẫu bột ngô nghiền mịn, chiết bằng đệm phosphat (Na2HPO4, KH2PO4), ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4o C,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
29
thu dịch. Thí nghiệm tiến hành tƣơng tự nhƣ xác định hoạt tính α - amylase nhƣng thay tinh bột bằng cazein 1%.
2.3.1.4. Xác định chiều dài rễ ở giai đoạn cây non
Xác định chiều dài rễ của 10 giống ngô ở giai đoạn cây non 5 ngày tuổi bằng thƣớc đo cm thông dụng.
Hạt ngô đƣợc gieo vào các chậu trồng chứa cát vàng đã rửa sạch, mỗi chậu trồng 30 cây. Tƣới nƣớc cho đến khi cây có 3 lá thật và đƣợc 5 ngày tuổi thì tiến hành nhổ rễ cây, rửa sạch cát cho cây nằm thẳng trên tờ giấy sạch rồi dùng thƣớc kẻ cm đo từ đầu rễ đến chóp rễ. Mỗi mẫu đƣợc đo lặp lại 3 lần lấy giá trị trung bình xử lý bằng Excel.
2.3.2. Phương pháp sinh học phân tử
2.3.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số theo phƣơng pháp của Gawel và đtg có cải tiến nhƣ sau [22]:
- Hóa chất: Nitơ lỏng, đệm rửa (Tris HCl 1 M; EDTA 0,5 M, pH = 8; Sorbitol 2 M; NaH2PO4 0,4%; H2O), đệm tách (Tris HCl 1 M; NaCl 5 M; EDTA; CTAB 4%; H2O), cồn 70%, Cloroform : Isoamy (24:1), Isopropannol 100%.
- Quy trình tách DNA:
+ Lấy 200 mg lá non nghiền trong nitơ lỏng thành bột mịn.
+ Bổ sung 0,8 ml đệm rửa, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, loại bỏ dịch nổi. Bƣớc này làm 2 lần.
+ Thêm 700 µl đệm tách, trộn nhẹ. Ủ 65o C ít nhất 1giờ, 5 phút lắc đều 1 lần, lấy ra để ở nhiệt độ phòng 5 phút.
+ Thêm 600 µl Cloroform : Isoamy (24:1), trộn đều 20 phút (dùng máy trộn càng tốt).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
30
+ Hút 500 µl dịch trong ở pha trên sang ống 1,5 ml, bỏ tủa.
+ Thêm 500 µl Isopropannol, trộn nhẹ, đặt lên đá (để tủ lạnh qua đêm) chờ có tủa trắng.
+ Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, bỏ dịch, úp xuống giấy cho khô. + Bổ sung 300 µl cồn 70% búng nhẹ.
+ Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ cồn (làm 2 lần). + Làm khô DNA bằng cách để trong box bật quạt.
+ Hòa tan DNA trong 50 µl nƣớc khử ion.
2.3.2.2. Định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của DNA tổng số
Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ
DNA đƣợc đo bằng máy quang phổ ở bƣớc sóng 260 nm và 280 nm. Nồng độ DNA đƣợc tính theo công thức:
Nồng độ DNA (ng/µl) = A260 x 50 x hệ số pha loãng Độ sạch DNA = A260/A280
Trong đó: A260 là chỉ số đo đƣợc ở bƣớc sóng 260 nm, A280 là chỉ số đo đƣợc ở bƣớc sóng 280 nm.
Nếu tỷ lệ A260/A280=1,8 - 2,0 thì DNA đó là tinh sạch.
Phƣơng pháp điện di
Điện di DNA bằng bộ điện di, chạy điện di ở điện thế 110V với gel agarose 0,8% trong dung dịch TAE 1X. Sản phẩm điện di đƣợc nhuộm bằng ethidium bromide, sau đó đƣợc soi dƣới ánh đèn UV và chụp ảnh.
2.3.2.3. Kỹ thuật PCR
Thực hiện phản ứng PCR nhân gen Cystatin với chu trình nhiệt: 94o C - 3 phút, 94o C - 30 giây, 52o C - 1 phút, 72o C - 1 phút, 72o C -10 phút, 4o C-.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
31
Bảng 2.2. Cặp mồi nhân gen cystatin
Mồi Trình tự mồi Nhiệt độ
gắn mồi
CF CATGCCATGGATGCGCAAACATCGAATCGTC 52o C
CR ATTTGCGGCCGCGCGCTAGCACCCTCTTCAA 52o C
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng nhân gen cystatin STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Buffer 10X 2,5 2 MgCl2 (25mM) 2,5 3 dNTP (2,5 mM) 2,0 4 Mồi xuôi (10 pM/µl) 2,0 5 Mồi ngược (10 pM/µl) 2,0 6 Taq-polymerase (5U/1µl) 1,0 7 DNA tổng số (50ng/ µl) 2,0 8 H2O 11,0 Tổng 25
Kiểm tra sản phẩm nhân gen: điện di sản phẩm nhân gen trên gel agarose 1%, nhuộm bản gel trong ethidium bromide. Sau đó soi và chụp ảnh dƣới ánh sáng đèn cực tím.
2.3.2.4. Làm sạch sản phẩm PCR (thôi gel)
Sau khi nhân đƣợc gen, bƣớc tiếp theo là cần thu nhận gen ở dạng sạch và không lẫn gel agarose để sử dụng cho công việc tạo dòng. Vì vậy chúng tôi tiến hành thôi gel để làm sạch sản phẩm PCR theo bộ kít AccuPrep® Gel Purification Kit (Bioneer):
Các bƣớc tiến hành:
- Điện di sản phẩm PCR (1 giếng sản phẩm, 1 giếng đối chứng, 1 giếng marker).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
32
- Cắt giếng marker và giếng đối chứng đi nhuộm và soi. - Cắt gel có sản phẩm.
- Cân gel theo quy ƣớc: 1 mg tƣơng đƣơng với 1 µl. - Bổ sung dịch GB theo tỉ lệ: V mẫu : VGB = 1: 5 (µl).
- Ủ ở 60o C trong 10 phút, 2 phút trộn nhẹ một lần, sau khi gel tan hết ủ thêm 2 phút cho gel tan hoàn toàn.
- Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột gel, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột.
- Bổ sung 500 µl GB, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột.
- Bổ sung 500 µl WB, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột.
- Thêm 500 µl WB để rửa sạch sản phẩm, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung thêm 1 phút để loại bỏ hết dịch WB.
- Chuyển cột sang ống Effendorf 1,5 ml.
- Hòa tan DNA trong 30 - 50 µl nƣớc khử ion khử trùng hoặc dung dịch EL, để ở nhiệt độ phòng 1 phút, sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Thu dịch chuyển sang ống DNA mới.
- Điện di kiểm tra sản phẩm thôi gel.
2.3.2.5. Tách dòng gen
Tạo plasmid tái tổ hợp
Sản phẩm PCR đã làm sạch đƣợc gắn trực tiếp vào vector pBT với thành phần phản ứng trong bảng 2.4.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
33
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Buffer T4 ligase 2,0 2 DNA 7,0 3 Vector pBT 1,0 4 T4 ligase (2 unit/µl) 1,0 5 H2O 9,0 Tổng 20,0
Hỗn hợp đƣợc ủ ở nhiệt độ 22o C trong 1,5 giờ và sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5 .
Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5
Lấy 7 µl sản phẩm lai cho vào ống đựng tế bào khả biến, trộn nhẹ. Đặt hỗn hợp vào trong đá 30 phút, sau đó ủ ở 42oC đúng 1 phút và cho vào đá 5 phút. Bổ sung 400 µl LB lỏng (peptone, cao nấm men, NaCl) nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37oC trong 1 giờ. Lấy ra cấy trải trên môi trƣờng LB đặc (peptone, cao nấm men, NaCl và agar) có kháng sinh ampicilin (100mg/l), IPTG (0,1 mM) và X - gal (40 mg/l). Chọn khuẩn lạc có màu trắng nuôi qua đêm trong môi trƣờng LB lỏng (có bổ sung ampicilin 100 mg/l).
Kiểm tra sản phẩm chọn dòng
Lấy dịch nuôi chứa khuẩn kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ phản ứng PCR nhân gen cystatin, nhƣng DNA tổng số thay bằng DNA plasmid (2 µl). Sản phẩm PCR chọn dòng đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X. Sau đó nhuộm gel trong ethidium bromide và chụp ảnh dƣới ánh sáng đèn cực tím.
Tách plasmid tái tổ hợp
Sau khi kiểm tra sản phẩm chọn dòng, tiến hành tách plasmid bằng bộ kít Bioneer. Các bƣớc tách plasmid:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
34
- Lấy dịch vi khuẩn ly tâm 3000 vòng/phút trong 7 phút, bỏ dịch thu cặn.
- Hòa cặn trong 250 l Resuspension (Buffer 1), đảo nhẹ.
- Bổ sung 250 l Lysis (Buffer 2) vào ống trên, lắc nhẹ.
- Bổ sung 350 l Neutralization (Buffer 3), lắc nhẹ để tránh kết tủa cục bộ.
- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. Hút dịch nổi cho chảy qua cột tinh sạch plasmid của hãng Bioneer.
- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột.
- Bổ sung 500 l Denaturation (Buffer D), ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột.
- Bổ sung 700 l Washing (Buffer 4), ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột. Bƣớc này có thể ly tâm thêm một lần nữa để loại bỏ hết Washing.
- Đặt cột sang ống 1,5 ml mới, cho 20 l H2O vào chính giữa cột, để ở nhiệt độ phòng khoảng 3 phút và ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Thu nhận plasmid.
Kiểm tra sản phẩm tách plasmide trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, nhuộm bản gel trong ethidium bromide và chụp ảnh dƣới ánh sáng đèn cực tím.
2.3.3. Phương pháp xác định trình tự nucleotide
- Trình tự của gen cystatin đƣợc xác định trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer (Applied Biosystem) sử dụng bộ hoá chất sinh chuẩn Big Dye® Terminator v3.1 cycle sequencing.
- Gen cystatin dài khoảng 405 bp nên trình tự nucleotide đƣợc đọc một chiều.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
35
2.3.4. Phương pháp xử lí trình tự gen
Sử dụng phần mềm DNAstar và BioEdit để phân tích, so sánh.
2.3.5. Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu
- Sử dụng phƣơng pháp thống kê bằng chƣơng trình Excel: xác định giá trị trung bình, phƣơng sai, độ lệch chuẩn, sai số trung bình mẫu…[10].
2.4. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Các thí nghiệm đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm của khoa Khoa học sự sống - Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên; Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ gen - Viện Khoa học sự sống - Đại học Thái Nguyên.
Trình tự DNA đƣợc xác định trên thiết bị giải trình tự DNA tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer tại Viện Công nghệ Sinh học Việt Nam.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
36
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÁC GIỐNG NGÔ NGHIÊN CỨU Ở GIAI ĐOẠN CÂY NON NGÔ NGHIÊN CỨU Ở GIAI ĐOẠN CÂY NON
Để đánh giá khả năng chịu hạn của các giống ngô nghiên cứu, tạo cơ sở cho việc chọn giống ngô có khả năng chịu hạn cao, chúng tôi tiến hành nghiên cứu, đánh giá nhanh khả năng chịu hạn bằng phƣơng pháp gây hạn nhân tạo của các giống ngô ở giai đoạn cây non theo tỉ lệ: tỉ lệ cây không héo, tỉ lệ cây phục hồi sau 3, 5, 7, 9 ngày thí nghiệm. Từ đây tính đƣợc chỉ số chịu hạn tƣơng đối của các giống ngô. Giống nào có chỉ số chịu hạn tƣơng đối càng lớn thì khả năng chịu hạn càng cao và ngƣợc lại.
Kết quả đánh giá nhanh khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non của các giống ngô nghiên cứu đƣợc trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non của 10 giống ngô
Tên giống
3 ngày 5 ngày 7 ngày 9 ngày
Chỉ số chịu hạn %CKH %CPH %CKH %CPH %CKH %CPH %CKH %CPH LVN9 76,67 63,33 43,33 23,33 16,67 6,67 0 0 2680 LVN10 100 100 86,67 73,33 56,67 50 16,67 13,33 10110 LVN45 93,33 80 66,67 63,33 43,33 36,67 10 6,67 6590 LVN61 83,33 66,67 46,67 36,67 20 13,33 0 0 3350 LVN66 90 73,33 63,33 56,67 33,33 23,33 6,67 6,67 5380 LVN092 86,67 66,67 56,67 50 23,33 16,67 6,67 0 4140 LVN99 93,33 83,33 73,33 66,67 50 46,67 13,33 10 7680 LVN145 93,33 100 66,67 80 43,33 56,67 10 23,33 8890 LVN885 73,33 63,33 36,67 16,67 10 6,67 0 0 2300 C919 100 100 93,33 83,33 73,33 63,33 33,33 30 12920
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
37
Từ bảng 3.1 cho thấy, giống C919 là giống chịu hạn tốt nhất có chỉ số chịu hạn là 12920, còn giống LVN885 chịu hạn kém nhất với chỉ số chịu hạn là 2300. Chỉ số chịu hạn càng lớn thì khả năng chịu hạn càng cao.
Chỉ số chịu hạn giảm dần ở các giống nhƣ sau:
C919 > LVN10 > LVN145 > LVN 99 > LVN45 > LVN66 > LVN092 > LVN61 > LVN9 > LVN885
Khả năng chịu hạn của các giống ngô nghiên cứu còn đƣợc biểu diễn bằng đồ thị hình rada ở các ngƣỡng thời gian hạn là: 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày (hình 3.1). Diện tích hình đa giác càng lớn thì khả năng chịu hạn càng cao. Diện tích hình lục giác là tổng diện tích các hình tam giác trong đồ thị hình rada. 0.000 0.200 0.400 0.600