Phương pháp xử lí trình tự gen

3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.3.4. Phương pháp xử lí trình tự gen

Sử dụng phần mềm DNAstar và BioEdit để phân tích, so sánh.

2.3.5. Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu

- Sử dụng phƣơng pháp thống kê bằng chƣơng trình Excel: xác định giá trị trung bình, phƣơng sai, độ lệch chuẩn, sai số trung bình mẫu…[10].

2.4. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Các thí nghiệm đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm của khoa Khoa học sự sống - Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên; Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ gen - Viện Khoa học sự sống - Đại học Thái Nguyên.

Trình tự DNA đƣợc xác định trên thiết bị giải trình tự DNA tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer tại Viện Công nghệ Sinh học Việt Nam.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

36

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÁC GIỐNG NGÔ NGHIÊN CỨU Ở GIAI ĐOẠN CÂY NON NGÔ NGHIÊN CỨU Ở GIAI ĐOẠN CÂY NON

Để đánh giá khả năng chịu hạn của các giống ngô nghiên cứu, tạo cơ sở cho việc chọn giống ngô có khả năng chịu hạn cao, chúng tôi tiến hành nghiên cứu, đánh giá nhanh khả năng chịu hạn bằng phƣơng pháp gây hạn nhân tạo của các giống ngô ở giai đoạn cây non theo tỉ lệ: tỉ lệ cây không héo, tỉ lệ cây phục hồi sau 3, 5, 7, 9 ngày thí nghiệm. Từ đây tính đƣợc chỉ số chịu hạn tƣơng đối của các giống ngô. Giống nào có chỉ số chịu hạn tƣơng đối càng lớn thì khả năng chịu hạn càng cao và ngƣợc lại.

Kết quả đánh giá nhanh khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non của các giống ngô nghiên cứu đƣợc trình bày ở bảng 3.1.

Bảng 3.1. Khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non của 10 giống ngô

Tên giống

3 ngày 5 ngày 7 ngày 9 ngày

Chỉ số chịu hạn %CKH %CPH %CKH %CPH %CKH %CPH %CKH %CPH LVN9 76,67 63,33 43,33 23,33 16,67 6,67 0 0 2680 LVN10 100 100 86,67 73,33 56,67 50 16,67 13,33 10110 LVN45 93,33 80 66,67 63,33 43,33 36,67 10 6,67 6590 LVN61 83,33 66,67 46,67 36,67 20 13,33 0 0 3350 LVN66 90 73,33 63,33 56,67 33,33 23,33 6,67 6,67 5380 LVN092 86,67 66,67 56,67 50 23,33 16,67 6,67 0 4140 LVN99 93,33 83,33 73,33 66,67 50 46,67 13,33 10 7680 LVN145 93,33 100 66,67 80 43,33 56,67 10 23,33 8890 LVN885 73,33 63,33 36,67 16,67 10 6,67 0 0 2300 C919 100 100 93,33 83,33 73,33 63,33 33,33 30 12920

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

37

Từ bảng 3.1 cho thấy, giống C919 là giống chịu hạn tốt nhất có chỉ số chịu hạn là 12920, còn giống LVN885 chịu hạn kém nhất với chỉ số chịu hạn là 2300. Chỉ số chịu hạn càng lớn thì khả năng chịu hạn càng cao.

Chỉ số chịu hạn giảm dần ở các giống nhƣ sau:

C919 > LVN10 > LVN145 > LVN 99 > LVN45 > LVN66 > LVN092 > LVN61 > LVN9 > LVN885

Khả năng chịu hạn của các giống ngô nghiên cứu còn đƣợc biểu diễn bằng đồ thị hình rada ở các ngƣỡng thời gian hạn là: 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày (hình 3.1). Diện tích hình đa giác càng lớn thì khả năng chịu hạn càng cao. Diện tích hình lục giác là tổng diện tích các hình tam giác trong đồ thị hình rada. 0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 %CKH3 %CPH3 %CKH5 %CPH5 %CKH7 %CPH7 %CKH9 %CPH9 LVN10 LVN99 LVN145 LVN885 C919 LVN9 LVN61 LVN66 LVN45 LVN092

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

38

Hình 3.2. Hình ảnh của 10 giống ngô nghiên cứu sau 7 ngày gây hạn

Từ kết quả đánh giá khả năng chịu hạn ở trên, chúng tôi đã lựa chọn giống ngô có chỉ số chịu hạn cao nhất là giống C919 và giống ngô có chỉ số chịu hạn thấp nhất là giống LVN885 để tiếp tục nghiên cứu và phân lập gen cystatin.

3.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ENZYM α- AMYLASE, PROTEASE, CHIỀU DÀI RỄ CỦA CÁC GIỐNG NGÔ.

3.2.1. Hoạt tính α - amylase

Hoạt tính của enzyme - amylase chịu ảnh hƣởng lớn của điều kiện ngoại cảnh. Khi cây ngô gặp hạn sẽ làm hàm lƣợng  - amylase tăng, từ đó làm tăng hàm lƣợng đƣờng và tăng áp suất thẩm thấu. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành đánh giá hoạt tính enzyme - amylase trong hạt của 10 giống ngô nghiên cứu. Kết quả đánh giá hoạt tính  - amylase của các giống ngô đƣợc thể hiện trong bảng 3.2.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

39

Bảng 3.2. Hoạt tính enzyme α – amylase của 10 giống ngô nghiên cứu STT Tên mẫu Hoạt độ α – amylase (D – d, mm)

1 LVN9 13,5 ± 0,07 2 LVN10 13 ± 0,25 3 LVN45 17 ± 0,1 4 LVN61 15 ± 0,15 5 LVN66 16 ± 0,1 6 LVN092 14 ± 0,26 7 LVN99 12 ± 0,17 8 LVN145 13 ± 0,14 9 LVN885 11 ± 0,15 10 C919 18 ± 0,12

Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy, các giống ngô nghiên cứu có hoạt tính enzyme - amylase khác nhau. Hoạt tính  - amylase biểu hiện mạnh nhất ở giống C919 (18 mm) và yếu nhất ở giống LVN885 (11 mm).

Hình 3.3. Hoạt tính của enzyme α- amylase của 10 giống ngô nghiên cứu

1. LVN885; 2. LVN61; 3. LVN10; 4. LVN99; 5. LVN9 6. LVN145; 7. LVN66; 8. LVN45; 9. LVN092; 10. C919

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

40

3.2.2. Hoạt tính protease

Protease là enzyme tham gia vào phân giải các protein lạ hoặc protein bị biến tính khi cây trồng gặp điều kiện cực đoan (hạn, lạnh, nóng…) [7]. Dựa vào sự đánh giá này, chúng tôi tiến hành xác định hoạt tính protease trong hạt của các giống ngô nghiên cứu. Kết quả xác định hoạt tính protease đƣợc thể hiện trong bảng 3.3.

Bảng 3.3. Hoạt tính của protease của 10 giống ngô nghiên cứu

Từ kết quả ở bảng 3.3 cho thấy, hoạt tính protease ở các giống ngô khác nhau là khác nhau: giống có hoạt tính protease cao nhất là C919 (18 mm), giống có hoạt tính protease thấp nhất là giống LVN885 (12 mm). Hoạt tính protease của các giống ngô theo thứ tự giảm dần nhƣ sau:

C919 > LVN45 = LVN66 = LVN145 > LVN99 > LVN10 = LVN092 > LVN9 = LVN61 > LVN885

STT Tên mẫu Hoạt độ protease (D – d, mm)

1 LVN9 13 ± 0,15 2 LVN10 14 ± 0,21 3 LVN45 17 ± 0,11 4 LVN61 13 ± 0,1 5 LVN66 17 ± 0,1 6 LVN092 14 ± 0,2 7 LVN99 16 ± 0,12 8 LVN145 17 ± 0,15 9 LVN885 12 ± 0,12 10 C919 18 ± 0,2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

41

Hình 3.4.Hoạt tính của protease của 10 giống ngô nghiên cứu

1. LVN61; 2. LVN885; 3. LVN10; 4. LVN9; 5. LVN092; 6. LVN45; 7. C919; 8. LVN145; 9. LVN99; 10. LVN66;

3.2.3. Chiều dài rễ của các giống ngô ở giai đoạn cây non

Bộ rễ là một trong những bộ phận quan trọng của cây thực hiện nhiệm vụ lấy nƣớc cung cấp cho các hoạt động sống và phát triển của cơ thể thực vật. Nhờ khả năng hƣớng nƣớc, rễ ngô có thể tìm nguồn nƣớc và nguồn thức ăn một cách chủ động. Khi cây ngô gặp hạn, bộ rễ phát triển mạnh và ăn sâu để có thể tìm kiếm các nguồn nƣớc từ các lớp đất sâu. Vì vậy, sự phát triển và khả năng đâm xuyên của bộ rễ cũng là những chỉ tiêu để đánh giá và nhận dạng các giống ngô có khả năng chịu hạn. Cũng có thể nghiên cứu kích thƣớc rễ ở giai đoạn cây non để đánh giá khả năng chống chịu của cây ngô.

Kết quả nghiên cứu kích thƣớc rễ của các giống ngô ở giai đoạn cây non 3 lá sau khi gây hạn đƣợc trình bày trong bảng 3.4.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

42

Bảng 3.4. Chiều dài rễ của 10 giống ngô nghiên cứu

Từ bảng 3.4 cho thấy, chiều dài rễ ở giai đoạn cây non sau khi gây hạn của các giống ngô nghiên cứu dao động từ 18,73 – 30,80 cm. Giống có chiều dài rễ ngắn nhất là LVN885 (18,73 cm), giống có chiều dài rễ dài nhất là C919 (30,80 cm). Chiều dài rễ của các giống ngô nghiên cứu đƣợc xếp theo thứ tự giảm dần nhƣ sau:

C919 > LVN145 > LVN99 > LVN10 > LVN45 > LVN66 > LVN61 > LVN092 > LVN9 > LVN885

Nhƣ vậy, chúng tôi nhận thấy có sự liên quan giữa khả năng chịu hạn và hoạt tính  - amylase, protease, chiều dài rễ. Những giống có khả năng chịu hạn tốt thì hoạt độ  - amylase, protease, chiều dài rễ cũng cao và ngƣợc lại những giống chịu hạn kém thì hoạt độ  - amylase, protease, chiều dài rễ thấp hơn so với giống chịu hạn tốt.

STT Tên giống Kích thước (cm)

1 LVN9 19,83 ± 0,25 2 LVN10 25,33 ± 0,35 3 LVN45 24,93 ± 0,06 4 LVN61 23,94 ± 0,16 5 LVN66 23,73 ± 0,25 6 LVN092 23,1 ± 0,12 7 LVN99 26,80 ± 0,19 8 LVN145 28,70 ± 0,17 9 LVN885 18,73 ± 0,23 10 C919 30,80 ± 0,11

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

43

3.3. KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN CYSTATIN

3.3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số

Lá non của cây ngô đƣợc sử dụng để tách chiết DNA tổng số. Sau khi tách chiết và tinh sạch, hàm lƣợng và độ sạch của DNA đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo quang phổ hấp thụ ở bƣớc sóng 260 nm và 280 nm. Đồng thời, DNA tổng số đƣợc điện di trên gel agarose 1% trong TAE 1X và chụp ảnh trên máy soi gel để đánh giá chất lƣợng DNA. Kết quả đƣợc thể hiện trong hình 3.5.

Hình 3.5. Hình ảnh điện di DNA tổng số của 10 giống ngô nghiên cứu

(1: LVN 9, 2: LVN 10, 3: LVN 45, 4: LVN 61, 5: LVN 66, 6: LVN 092, 7: LVN 99, 8: LVN 145, 9: LVN 885, 10: C 919)

Tiến hành kiểm tra độ tinh sạch và hàm lƣợng của DNA tổng số bằng phƣơng pháp đo trên máy quang phổ. Kết quả thu đƣợc thể hiện ở bảng 3.5.

Bảng 3.5 cho thấy: tỷ số A260/A280 dao động trong khoảng 1,8 - 2,0 chứng tỏ các mẫu DNA tách chiết có độ tinh sạch cao, có thể sử dụng để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

44

Bảng 3.5. Phổ hấp phụ DNA ở bước sóng 260 nm và 280 nm

của 10 giống ngô nghiên cứu

STT Mẫu OD 260 (nm) OD 280 (nm) Tỷ số OD Nồng độ DNA ng/µl 1 LVN 9 0,017 0,009 1,89 85 2 LVN 10 0,035 0,019 1,84 175 3 LVN 45 0,013 0,007 1,86 65 4 LVN 61 0,015 0,008 1,88 75 5 LVN 66 0,023 0,012 1,92 115 6 LVN 092 0,029 0,015 1,93 145 7 LVN 99 0,025 0,013 1,92 125 8 LVN 145 0,025 0,014 1,79 125 9 LVN 885 0,019 0,01 1,9 95 10 C 919 0,014 0,007 2,00 70

3.4.2. Kết quả nhân gen cystatin

Sau khi tách chiết DNA tổng số, tinh sạch, pha loãng với nồng độ 50ng/µl, chúng tôi đã tiến hành nhân gen cystatin của 2 giống ngô (một giống chịu hạn tốt và một giống chịu hạn kém) bằng phƣơng pháp PCR. Kết quả nhân gen đƣợc kiểm tra trên gel agarose 1% cùng với marker và đƣợc thể hiện ở hình 3.6.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

45

1 1 2 2 M

Hình 3.6. Hình ảnh điện di kết quả PCR nhân gen cystatin

Sản phẩm của phản ứng PCR thu đƣợc ở hình 3.6 cho thấy chỉ có một băng DNA duy nhất với kích thƣớc khoảng 405 bp, phù hợp với kích thƣớc tính toán của chúng tôi ban đầu, chứng tỏ phản ứng PCR thành công.

3.4.3. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR

Vì sản phẩm PCR nhân gen cystatin có các sản phẩm phụ không mong muốn, các nucleotide dƣ thừa sau phản ứng, mồi, enzyme…Vì vậy, để quá trình biến nạp đạt hiện quả cao nhất, chúng tôi đã tiến hành tinh sạch (thôi gel) sản phẩm PCR bằng bộ kít AccuPrep® Gel Purification (Bioneer). Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR đƣợc thể hiện ở hình 3.7.

Ghi chú: 1. LVN 885; 2. C919; M. Marker 1kb

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

46

M 1 2

Hình 3.7. Hình ảnh điện di sản phẩm thôi gel

Ghi chú: 1. LVN885; 2. C919; M. Marker 1kb

Từ hình 3.7 cho thấy sau khi điện di sản phẩm thôi gel cho một băng DNA duy nhất với kích thƣớc khoảng 405 bp, chứng tỏ đã thu nhận đƣợc đoạn gen cystatin mong muốn.

3.4.4. Kết quả tách dòng gen cystatin

Sản phẩm PCR nhân gen cystatin đƣợc làm sạch bằng bộ kít thôi gel, sau đó đƣợc gắn vào vector pBT để tạo vector tái tổ hợp. Vector tái tổ hợp đƣợc biến nạp vào vi khuẩn E.coli DH5 bằng phƣơng pháp sốc nhiệt ở 42oC. Sau đó, nuôi vi khuẩn E.coli DH5 đã biến nạp trên môi trƣờng LB đặc nhƣ mô tả ở mục 2.4.5.

Sau 16 giờ nuôi ổn định ở 37o C, trên đĩa petri xuất hiện các khuẩn lạc màu xanh và màu trắng nhƣ hình 3.8.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

47

Hình 3.8. Hình ảnh khuẩn lạc

3.4.5. Kết quả chọn lọc plasmid tái tổ hợp bằng colony-PCR

Chọn 4 khuẩn lạc có màu trắng, hình tròn đều trên đĩa thạch chuyển sang nuôi qua đêm trong môi trƣờng LB lỏng (có bổ sung ampicilin). Lấy dịch nuôi khuẩn thực hiện phản ứng colony - PCR với chính cặp mồi đặc hiệu đã nhân gen để xác định khuẩn lạc có mang gen mong muốn. Sản phẩm colony - PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% trong TAE 1X. Kết quả điện di sản phẩm colony - PCR đƣợc thể hiện ở hình 3.9.

M 1 2

Hình 3.9. Hình ảnh điện di sản phẩm colony – PCR

Ghi chú: 1. LVN885; 2. C919; M. Marker 1kb 500bp

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

48

Từ kết quả điện di trên hình 3.9 cho thấy, sản phẩm colony - PCR từ những khuẩn lạc trắng đều cho một băng duy nhất có kích thƣớc khoảng 405bp, chứng tỏ kết quả biến nạp và chọn dòng thành công.

3.4.6. Kết quả tách plasmid tái tổ hợp

Chọn khuẩn lạc trắng tƣơng ứng với 2 mẫu nghiên cứu có sản phẩm colony - PCR ở trên tách plasmid tái tổ hợp theo bộ kít của hãng Bioneer. Sản phẩm DNA plasmid tái tổ hợp đƣợc điện di trên gel agarose 1% trong TAE 1X. Kết quả điện di tách plasmid đƣợc thể hiện ở hình 3.10.

1 2

Hình 3.10. Hình ảnh điện di tách plasmid tái tổ hợp

1. Plasmid mang gen cystatin của giống LVN885 2. Plasmid mang gen cystatin của giống C919

Kết quả điện di trên hình 3.10 cho thấy, sản phẩm tách plasmid sạch, đảm bảo chất lƣợng và số lƣợng để tiến hành đọc trình tự nucleotide của gen cystatin.

3.5. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN CYSTATIN

Để xác định trình tƣ̣ nucleotide của gen cystatin đã tách dòng, chúng tôi gửi đọc trình tƣ̣ nucleotide của gen cystatin trên thiết bị giải trình tƣ̣ tƣ̣ động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer tại viện Công nghệ Sinh học. Kết quả đƣợc phân tích bằng phần mềm BioEdit.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

49

Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen cystatin của giống ngô LVN885 với gen cystatin D38130 trên Ngân hàng gen NCBI đƣợc trình bày ở hình 3.11.

Kết quả cho thấy kích thƣớc của gen cystatin ở giống ngô LVN885 và D38130 trên Ngân hàng gen NCBI có kích thƣớc 405 nucleotide. Chúng tôi kết luận đã khuếch đại, tách dòng, giải trình tự nucleotide thành công đoạn gen của giống LVN885. So sánh trình tự nucleotide của gen cystatin ở giống ngô LVN885 và D38130 trên Ngân hàng gen cho thấy, hai trình tự này chỉ khác nhau ở 3 vị trí là 354, 355 và 362. Do vậy trình tự gen cystatin của giống ngô LVN885 và D38130 có hệ số tƣơng đồng nucleotide cao là 99,2%.

Hình 3.11. So sánh trình tự nucleotide của gen cystatin ở LVN885 với D38130

Việc nghiên cứu một gen nào đó, ngoài trình tự nucleotide ngƣời ta