Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại trình tự gen mã hóa ARNr 16S từ ADN tổng số của các chủng vi khuẩn TL4, NS1 và BC sử dụng cặp mồi đặc hiệu GF1 và GR1.
Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Kích thước của các đoạn ADN thu được sau phản ứng PCR được so sánh với thang ADN chuẩn (Fermentas). Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit PureLinkTM ADN Purification (Invitrogen).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 56
Kết quả trên cho thấy phản ứng PCR trong thí nghiệm này cho một băng duy nhất, có kích thước khoảng 1,4 kb (hình 3.13).
Hình 3.13.Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại trình tự gen mã hóa ARNr 16S của các chủng Lactobacillus phân lập đƣợc trên gel agarose 1%.
Băng M: thang chuẩn (Fermentas); Đường chạy 1-3: Sản phẩm PCR khuếch đại trình tự gen mã hóa ARNr 16S lần lượt của các chủng TL4, NS1 và BC
3.5.3. Kết quả xác định trình tự gen mã hóa ARNr 16S của các chủng TL4, NS1, BC
Kết quả đọc trình tự gen hai chiều được kiểm tra bằng phần mềm phân tích ADN STAR (Lasergene Inc., Madison, WI, Mỹ), so sánh với các gen tương ứng đăng ký trên ngân hàng cơ sở dữ liệu GenBank bằng công cụ BLAST trên NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). Trình tự nucleotide của gen mã hóa ARNr 16S được phân tích và so sánh với trình tự nucleotide tương ứng lần lượt bằng công cụ Clustal-X (ver.1.83); Đánh giá mức độ tương đồng di truyền giữa các chủng vi khuẩn nghiên cứu với các chủng vi khuẩn khác được xây dựng dựa trên phần mềm ClustalX 2.0.11.
*Phân loại chủng TL4:
Trình tự gen mã hóa ARNr 16S của chủng vi khuẩn TL4 được trình bày phần ở phụ lục 1. Khi so sánh các trình tự gen nhận được trong nghiên cứu với các trình tự gen tương ứng trên ngân hàng dữ liệu cơ sở GenBank bằng công cụ BLAST (NCBI): ARNr 16S của chủng TL4 có độ tương đồng cao (99%) so với gen tương ứng của các chủng Lactobacillus plantarum (Bảng 3.12). Như vậy, kết quả phân loại cho thấy chủng vi khuẩn TL4 thuộc loài Lactobacillus plantarum. Trình tự gen mã hóa ARNr 16S của chủng Lactobacillus plantarum TL4 được đăng ký trên GenBank (NCBI) dưới mã số truy nhập là JQ937330. (phụ lục 4).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 57
Bảng 3.12. Kết quả so sánh trình tự gen mã hóa ARNr 16S của chủng
L. plantarum TL4 phân lập đƣợc với gen tƣơng ứng của các chủng vi khuẩn đƣợc đăng ký trên GenBank
Trình tự gen mã hóa ARNr 16S của các chủng vi khuẩn lactic đƣợc so sánh Mã số truy cập trên GenBank Độ tƣơng đồng (%) Lactobacillus plantarum L544 JQ801725 99
Lactobacillus plantarum LA113 JQ801724 99
Lactobacillus plantarum JNB25 JQ741971 99
Lactobacillus plantarum CHCHX JQ446567 99
Lactobacillus plantarum QTEN6.3AN JQ446537 99
Lactobacillus plantarum QP1 JQ446454 99 Lactobacillus plantarum GF103 JQ411248 99 Lactobacillus sp.WX131 JQ046407 99 Lactobacillus plantarum J4 JN587505 99 Lactobacillus plantarum 033 JN560899 99 Lactobacillus plantarum 019 JN560843 99 Lactobacillus plantarum B14 HQ450742 99
Lactobacillus plantarum KU13 HQ542228 99
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 58
với các chủng vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus khác
*Phân loại chủng NS1:
Kết quả đọc trình tự gen mã hóa ARNr 16S của chủng vi khuẩn NS1 được trình bày ở phần phụ lục 2. Khi so sánh các trình tự gen nhận được trong nghiên cứu với các trình tự gen tương ứng trên ngân hàng dữ liệu cơ sở GenBank bằng công cụ BLAST (NCBI): ARNr 16S của chủng NS1 có độ tương đồng cao (99%) so với gen tương ứng của các chủng L. pentosus (Bảng 3.13). Như vậy, kết quả phân loại cho thấy chủng vi khuẩn NS1 thuộc loài Lactobacillus pentosus.
Bảng 3.13. Kết quả so sánh trình tự gen ARNr 16S của chủng Lactobacillus pentosus NS1 phân lập đƣợc với gen tƣơng ứng của các chủng vi khuẩn
đƣợc đăng ký trên GenBank Trình tự gen mã hóa ARNr 16S của các
chủng vi khuẩn lactic đƣợc so sánh
Mã số truy cập trên GenBank
Độ tƣơng đồng (%)
Lactobacillus pentosus NRIC 1836 AB362757 99
Lactobacillus pentosus NRIC 1837 AB362758 99
Lactobacillus pentosus NRIC 1835 AB362756 99
Lactobacillus plantarum NRIC 1834 AB362755 99
Lactobacillus pentosus NRIC 1833 AB362754 99
Lactobacillus paraplantarum NRIC 1733 AB362736 99
Lactobacillus arizonensis DSM 13273 AJ965487 99
Lactobacillus pentosus NRIC 1837 AB362758 99
Lactobacillus pentosus NRIC 1827 AB362748 99
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 59
Hình 3.15. Mức độ tƣơng đồng di truyền giữa chủng L. pentosus NS1 với các chủng vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus khác
*Phân loại chủng BC:
Kết quả đọc trình tự gen mã hóa ARNr 16S của chủng vi khuẩn BC được trình bày ở phần phụ lục 3. Khi so sánh các trình tự gen nhận được trong nghiên cứu với các trình tự gen tương ứng trên ngân hàng dữ liệu cơ sở GenBank bằng công cụ BLAST (NCBI): ARNr 16S của chủng NS1 có độ tương đồng cao (99%) so với gen tương ứng của các chủng Lactobacillus fermentum (Bảng 3.14). Như vậy, kết quả phân loại cho thấy chủng vi khuẩn BC thuộc loài Lactobacillus fermentum.
Bảng 3.14. Kết quả so sánh trình tự gen mã hóa ARNr 16S của chủng
Lactobacillus fermentum BC phân lập đƣợc với gen tƣơng ứng của các chủng vi khuẩn đƣợc đăng ký trên GenBank Trình tự gen mã hóa ARNr 16S của các
chủng vi khuẩn lactic đƣợc so sánh Mã số truy cập trên GenBank Độ tƣơng đồng (%) Lactobacillus fermentum ZN7b-7 JQ801717 99 Lactobacillus fermentum HT4 JF414110 99 Lactobacillus fermentum SM-7 HM629735 99 Lactobacillus fermentum F1 HM036120 99 Lactobacillus fermentum NWL17 HQ293040 99
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 60
Lactobacillus fermentum NWL26 HQ293049 99
Lactobacillus fermentum NWS09 HQ111079 99
Hình 3.16. Mức độ tƣơng đồng di truyền giữa chủng Lactobacillus fermentum
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 61
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận:
Qua nuôi cấy, phân lập và nghiên cứu một số đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn lactic từ các sản phẩm lên men tại khu vực thành phố Thái Nguyên, chúng tôi đưa ra những kết luận sau:
1. Đã phân lập, tuyển chọn được 14/24 chủng mang các đặc điểm của chi
Lactobacillus từ 10 sản phẩm lên men.
2. Đã tuyển chọn được 4/14 chủng Lactobacillus có khả năng sinh axít lactic cao từ 2,95% đến 3,72%.
3. Đặc điểm nuôi cấy thích hợp cho các chủng TL4, NS1, BC và BB2: nhiệt độ từ 30 ÷ 340C; pH từ 5,5 ÷ 6,5; nồng độ glucose bổ sung từ 2 ÷ 4%; nồng độ NaCl bổ sung từ 1 ÷ 2%.
4. Các chủng TL4, NS1, BC và BB2 tuyển chọn được khảo sát đặc tính probiotic trong điều kiện in vitro: Đều có khả năng sống sót ở pH môi trường 2 ÷ 8; Bốn chủng đều có khả năng phát triển trong môi trường có bổ sung muối mật 0,3%; Cả 4 chủng TL4, NS1, BC và BB2 đều có khả năng ức chế cả vi khuẩn kiểm định Gram âm, Gram dương và không có biểu hiện đối kháng nhau.
5. Đã phân loại được 03 chủng Lactobacillus phân lập được là: Lactobacillus plantarum TL4, Lactobacillus pentosus NS1, Lactobacillus fermentum BC. Trong đó, trình tự gen mã hóa ARNr 16S của chủng Lactobacillus plantarum
TL4 được đăng ký ngân hàng gen thế giới với mã số truy nhập là JQ937330
Kiến nghị:
1. Đánh giá khả năng mẫn cảm của các chủng Lactobacillus plantarum TL4,
Lactobacillus pentosus NS1, Lactobacillus fermentum BC với các loại kháng sinh sử dụng trong chăn nuôi.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 62
2. Nghiên cứu động học lên men của các chủng Lactobacillus plantarum TL4,
Lactobacillus pentosus NS1, Lactobacillus fermentum BC tạo chế phẩm sinh học sử dụng cho vật nuôi.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tiếng Việt
1. Hoài Anh (2008), “Probiotic – lợi ích và triển vọng”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật chăn nuôi 1, tr. 37-39.
2. Hồ Lê Quỳnh Châu, Hồ Trung Thông, Nguyễn Thị Khánh Quỳnh(2010), “Đánh giá khả năng bám dính và kháng khuẩn ở mức độ in vitro của một số chủng vi sinh vật có tiềm năng sử dụng làm probiotic”, Tạp chí khoa học, Đại học Huế, số 57, tr. 5-13.
3. Ngô Thị Phương Dung, Huỳnh Thị Yến Ly, và Huỳnh Xuân Phong (2011),
“Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng sinh chất kháng khuẩn”, Tạp chí Khoa học 19a, tr. 176-184.
4. Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Muộn, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học Tập 1, Nhà xuất bản KHKT Hà Nội.
5. Nguyễn Thành Đạt (2005), Cơ sở sinh học vi sinh vật, Nhà xuất bản Đại học Sư phạm, Hà Nội.
6. Nguyễn Thúy Hương, Trần Thị Tưởng An (2008), “Thu nhận bacteriocin bằng phương pháp lên men bởi tế bào Lactococcus lactic cố định trên chất mang cellulose vi khuẩn (BC) và ứng dụng trong bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu”, Tạp chí Phát triển Khoa học & Công nghệ, tập 11, số 9, tr.100-109 7. Phạm Thị Ngọc Lan (2007), Ảnh hưởng của chủng có tính chất probiotic lên
khu hệ vi khuẩn đường ruột và sự tăng trọng của gà trong điều kiện bình thường và khi chịu stress nhiệt, Luận án tiến sỹ khoa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
8. Mai Thị Đàm Linh, Đỗ Minh Phương, Phạm Thị Tuyết, Kiều Hữu Ảnh và Nguyễn Thị Giang (2008), “Đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn lactic
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 63
phân lập trên địa bàn thành phố Hà Nội”, Tạp chí Khoa học Đại học Quốc Gia Hà Nội, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ (24), tr. 221-226.
9. Đào Thị Lương, Nguyễn Thị Anh Đào, Nguyễn Thị Kim Quy, Trần Thị Lệ Quyên, Dương Văn Hợp (2010), “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic dùng trong chế biến và bảo quản thức ăn thô xanh và phụ phẩm nông nghiệp cho gia súc nhai lại”,
Tạp chí di truyền và ứng dụng- Chuyên san Công nghệ sinh học (6), tr. 1-6.
10.TCN – TQTP 0013:2006, “Thường quy kỹ thuật xác định tổng số vi khuẩn Lactic trong thực phẩm”, Tiêu chuẩn Ngành y tế.
11.TCVN 5860–1994 Phương pháp xác định độ axít chung.
12.Nguyễn Thế Trang (2011), Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn lactic tạo chế phẩm bảoquản cá, Luận án tiến sĩ sinh học, Viện Công nghệ sinh học Việt Nam.
13.Hoàng Toàn Thắng, Cao Văn (2006), “Giáo trình sinh lý học vật nuôi”, Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội.
14.Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành (2006), “Công nghệ vi sinh và môi trường”,
Công nghệ sinh học tập 5, NXB Giáo dục, 2006.
15.Hồ Trung Thông, Hồ Lê Quỳnh Châu (2009), “Nghiên cứu khả năng sống trong môi trường đường tiêu hóa của động vật của một số chủng vi sinh vật nhằm từng bước chọn lọc tạo nguyên liệu sản xuất probiotic”, Tạp chí khoa học, Đại học Huế, Số 55, tr. 81-94.
16.Lê Hoàng Bảo Vi, Trương Thị Quỳnh Như, Vương Nam Trung, Phạm Huỳnh Ninh, Trần Thu Hoa, Phan Văn Sỹ (2006), “Sản xuất chế phẩm vi sinh (probiotic) sử dụng trong thức ăn chăn nuôi” Tạp chí Chăn nuôi số 12, tr. 21-25.
17.Trần Quốc Việt, Bùi Thị Thu Huyền, Dương Văn Hợp và Vũ Thành Lâm (2009), “Phân lập, tuyển chọn và đánh giá các đặc tính probiotic của một số chủng vi sinh vật hữu ích để sản xuất các chế phẩm probiotic dùng trong chăn nuôi”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 16, tr. 1-12.
II. Tiếng Anh.
18.Arti Dumbrepatil, Mukund Adsul, Shivani Chaudhari, Jayant Khire, and Digambar Gokhale (2008), “Utilization of molasses sugar for lactic acid production by
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 64
Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii Mutant Uc-3 in batch fermentation”,
Applied and environmental microbiology vol 74 (1), pp. 333–335.
19.Arturo A.., Mario Rosa M., Maria A.M. (2006), “Probiotic for animal nutrition in the European Union”, Regulation and safety assessments, 45, pp. 91-95.
20.Begon M., Harper J. L., Townsend C. R. (1996), “Ecology: Individuals, populations and communities”, Blackwell Science.
21.Bergey's manual of systematic bacteriology (1984), Williams & Wilkins, Vol 2, pp. 158-168
22.Bielecki S., Krystynowics A.., Turkiewicz M., Kalinowska H., “Bacteria cellulose”, Technical University of Lodz, Stefanowskiego Poland, pp. 37-46.
23.Boylston T.D., Vinderola C.G., Ghoddusi H.B. and Reinheimer J.A. (2004), “Incorporation of Bifidobacteria into cheese: challenges and rewards”,
International Dairy Journal 14, pp. 375-387.
24.Coconnier M.H., Klaenhammer T.R., Kerneis S., Bernet M.F. and Servin A.L. (1992), “Acidophilus BG2FO4 on human enterocyte and Protein-mediated adhesion of Lactobacillus mucus-secreting cell lines in culture” Applied and Environmental Microbiology 58(6), pp. 2034-2028.
25.Corzo G., Gilliand S.E. (1999), “Bile salt hydrolase activity of three strains of
Lactobacillus acidophilus”, Journal of dairy science Vol. 82, No. 3.
26.Du Toit M., Franz C., Schillinger U., Warles B. and Holzapfel W. (1998), “Characterization and selection of probiotic lactobacilli for a preliminary mini pigfeeding trail and their effect on serum cholesterol level, faeces moisture contents”, International Journal of Food Microbiology 40, pp. 93-104.
27.FAO/WHO (2001), “Health and Nutritional Properties of Probiotic in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria”, Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotic in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria Argentina.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 65
28.FAO/WHO (2002), “Guidelines for the Evaluation of Probiotic in Food”, Joint FAO/WHO Working Group Report on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotic in Food London, Ontario,Canada.
29.Fuller R. (1989), “Probiotic in man and animals”, Journal of applied bacteriology (66), pp. 365-378.
30. Fuller R. (1992), “History and development of probiotic”, In: R. Fuller (Ed.) Probiotic: The Scientific Basis, Chapman & Hall, London pp. 1−8.
31.Gilliland S.E., and Walker D.K. (1990), “Factors to consider when selecting a culture of Lactobacillus acidophilus as a dietary adjunct to produce a hypocholesterolemic effect in humans”, Journal of Dairy Science 73, pp. 905- 911.
32.Glenn R., Gibson, Helena Parracho, Anne L., McCartney (2007), “Probiotic and prebiotics in infant nutrition”, Proceedings of the Nutrition Society, 66, pp. 405– 411.
33.Haddadin M.S.Y., Awaisheh S.S. and Robinson R.K. (2004), “The production of yoghurt with probiotic bacteria isolated from infants in Jordan”, Pakistan Journal of Nutrition 3 (5), pp. 290-293.
34.Hollang K.T., Knapp J.S., Shoesmith J.G. (1987), “ Anaerobic Bacteria”, CVM6202: Microbiology ,1st ed. Blackie and Son, Ltd., London.
35.Hoque M.Z., Akter F., Hosain K.M., Rahman M.S.M., Billah M.M and Islam K.M.D. (2010). “Isolation, identification and analysis of probiotic properties of
Lactobacillus spp. from selective regional yoghurts”, World Journal of Dairy & Food Sciences 5 (1) pp. 39-46.
36.Liong M.T., Shah N.P. (2005), “Acid and bile tolerance and cholesterol removal ability of lactobacilli strains”, Journal of Dairy Science 88, pp. 55-66.
37.Newman M.G. (2002), “Antibiotics resistance is a reality: novel techniques for overcomingantibiotic resistance when using new growth promoters”, Nutritional biotechnology in the feed and food industries, proceedungs of alltech’s 18th
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 66
38.Mandal S., Puniya A.K. and Singh K. (2006), “Effect of alginate concentration on survival of encapsulated Lactobacillus casei NCDC-298”, International Dairy Journal 16, pp. 1190-1195.
39.Michail S. (2005), “The Mechanism of Action of Probiotic”, Wright State University School of Medicine, The Children’s Medical Center, Dayton, Ohio.
40.Mishra C., Lambert J. (1996), “Production of anti-microbial substances by probiotic”, Asia Pacific J Clin Nutr 5, pp. 20–24.
41.Patricia Neysens, Winy Messens, Luc De Vuyst (2003), “Effect of sodiumchloride on growth and bacteriocin production by Lactobacillus amylovorus DCE 471”, International Journal of Food Microbiology, 88, pp. 29– 39.
42.PPeeddeerrsseenn CC..,, JJoonnssssoonn HH..,, LLiinnddbbeerrgg JJ..EE..,, RRooooss SS.. ((22000044)), “Microbiological ,
characterization of wet wheat – distillers’ grain, with focus on isolation of
lactobacillus with potential as probiotic”, Environment microbiolagical, pp. 1522-1527.
43.Prasad J., Gill H.S., Smart J. and Gopal P.K. (1998), “Selection and characterization of Lactobacillus and Bifidobacterium strains for use as probiotics”, International Dairy Journal 8, pp. 993-1002.
44.Ross G.R., Gusils C., and Gonzalez S.N. (2008), “Microencapsulation of Probiotic Strains for Swine Feeding”, Biol. Pharm. Bull, 31(11), pp. 2121 - 2125.
45.Sahney S., Benton M.J. and Ferry P.A. (2010). “Links between global taxonomic diversity, ecological diversity and the expansion of vertebrates on land”, Biology Letters 6 (4): 544–547.
46.Sambrook J., Russell DW. (2001) Molecular cloning a vi khuẩn lacticoratory manual, 3rd Cold, Spring Harbor Vi khuẩn lacticoratory, Cold Spring Harbor, NY.
47.Sameh H.M. (2003), “Influence of Different Capsule Materials on the