C: mẫu đối chứng, 1-5: mẫu bệnh nhân MK: Marker 100bp
4.3.2.Đột biến trong vùng không mã hóa gen (intron)
CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN
4.3.2.Đột biến trong vùng không mã hóa gen (intron)
Vùng cắt nối nằm cách vị trí 5’ và 3’ của mỗi exon khoảng 20 đến 40 nucleotid gồm: vùng nhận (Acceptor site) và vùng cho (Donor site) là hai vùng quan trọng nhất, chứa các motif đặc hiệu liên kết với các tiểu đơn vị phức hợp Protein - RNA như U1 và U2. Hai đột biến ở vùng intron của gen COL1A1 được tìm thấy trên bệnh nhân OI trong nghiên cứu này đều cách từ 1 đến 31 nucleotid quanh vị trí 5’ tận của exon, nghĩa là nằm trên vùng nhận (Acceptor site), nơi tạo liên kết đặc hiệu với các protein U2 trong quá trình cắt nối tạo mRNA hoàn thiện.
Giải trình tự gen COL1A1 với cặp mồi đặc hiệu exon 6 - exon 9 trên bệnh nhân mã số 4, nghiên cứu phát hiện được một đột biến 769-1G>C trên intron 8 nằm cách exon 9 một nucleotid. Như đã nói ở trên, đột biến này nằm trên vùng nhận của intron 8; do đó nó ảnh hưởng tới quá trình hoàn thiện mRNA, cụ thể là quá trình cắt nối exon 8 – intron 8 – exon 9. Trong trường hợp này, đột biến có thể gây mất exon 8 (skip exon). Đây là đột biến được công bố tại ngân hàng dữ liệu về bệnh OI (mã số: AN_001039). Vào năm 2006, hai dạng đột biến dị hợp tử rất rõ ở vị trí cắt nối được tìm thấy trên 3 bệnh nhân OI, trong đó đột biến 769-1G>C nằm trên bệnh nhân OI týp I [27]. Tuy nhiên, trong nghiên cứu của chúng tôi, bệnh nhân mang đột biến đã được chẩn đoán lâm sàng mắc bệnh OI týp IV.
Như vậy, một lần nữa vai trò của việc phát hiện đột biến trên gen bệnh nhân mắc OI càng được khẳng định trong việc xác định thể bệnh.
Bệnh nhân mã số 5 (1795-31C>T)
Đột biến 1795-31C>T dị hợp tử tại intron 24 xuất hiện ở bệnh nhân mã số 5 cách đầu 5’ của exon 25 khoảng 31 nucleotid. Vị trí đột biến thuộc vùng nhận của intron 24, do đó nó có thể gây nhiễu vị trí cắt nối giữa exon 24 và exon 25. Tuy nhiên theo thống kê trong ngân hàng dữ liệu về bệnh OI hầu hết các đột biến gây bệnh OI nằm trên intron đều nằm rất gần đầu 5’ hoặc 3’ của exon. Việc tìm thấy đột biến ở vị trí cách đầu 5’ của exon 25 tới 31 nucleotid cần phải được kiểm tra lại chính xác bằng RT-PCR để xác định ảnh hưởng của nó tới quá trình cắt nối hoàn thiện mRNA. Bệnh phẩm cần phải lấy từ nơi có biểu hiện là da hoặc xương bệnh nhân, đem tách chiết RNA, tổng hợp cDNA; từ đó thực hiện RT-PCR và giải trình tự cDNA thu được. Do nghiên cứu của chúng tôi chỉ được thực hiện trong thời gian có hạn nên nghiên cứu chỉ dừng lại ở phát hiện đột biến trên gen COL1A1 của bệnh nhân.
KẾT LUẬN
Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen tìm đột biến gen COL1A1 trên bệnh nhân tạo xương bất toàn phát hiện được 5/5 bệnh nhân có đột biến điểm trên gen COL1A1; trong đó 3/5 đột biến xảy ra trên exon và 2/5 đột biến trên intron. Đột biến trên exon phát hiện được gồm 1 đột biến missense, 1 đột biến nonsense, 1 đột biến mất một acid amin. Trong 5 đột biến phát hiện được, 4/5 đột biến là đột biến thay thế, 1/5 là đột biến xóa nucleotide.
Do điều kiện thời gian hạn chế, cỡ mẫu nhỏ nên nghiên cứu chưa thể đưa ra tỷ lệ các đột biến trên gen COL1A1 gây bệnh OI tại Việt Nam. Vì vậy nghiên cứu cần được tiếp tục với thời gian lâu hơn, cỡ mẫu lớn hơn để có thể đưa ra tỷ lệ đột biến trên gen COL1A1 gây bệnh OI tại Việt Nam cũng như ảnh hưởng của đột biến trên người bệnh một cách chính xác, nhằm phục vụ cho công tác chẩn đoán, điều trị, tiên lượng và tư vấn di truyền bệnh được tốt hơn.