C: mẫu đối chứng, 1-5: mẫu bệnh nhân MK: Marker 100bp
CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN
4.3. Kết quả xác định đột biến gen COL1A1 trên bệnh nhân O
Theo thống kê tại ngân hàng dữ liệu về bệnh OI (Osteogenesis Imperfecta Variant Database), cho đến thời điểm hiện nay, có 1296 dạng đột biến trên gen COL1A1 (58%), còn lại 42% các đột biến nằm trên các gen khác như COL1A2, BMP1, CRTAP, FKBP10, LEPRE1, PLOD2, PPIB, SERPINF1, SERPINH1, SP7 và một số gen chưa được phát hiện.
Như đã đề cập, cơ chế sinh bệnh OI là do sự bất thường của collagen. Đó là loại protein cấu trúc nằm ở khuôn nền ngoại bào (ECM – extracellular matrix). Các phân tử protein này có vai trò làm kết dính, tạo độ bền cho những cấu trúc có hình dạng của cơ thể như khung xương, nhãn cầu; gọi là bộ khung của các cấu trúc.
Collagen týp I là một loại protein collagen mà cấu trúc điển hình của nó gồm một hay nhiều vùng mang hình thái
chuỗi xoắn ba helix có chứa bộ ba acid amin Gly-X-Y. Glycin (Gly) là acid amin trung tính không phân cực, nằm phía trong lõi của chuỗi xoắn. X là Prolin trong 1/3 trường hợp, Y thường là hydroxyprolin phân bố ở bề mặt ngoài của cấu trúc.
Mỗi phân tử collagene I cấu tạo gồm hai chuỗi tiền collagen α1 (procollagen - α1) mã hóa bởi gen COL1A1 và một chuỗi tiền collagen α2 (procollagen - α2) mã hoá bởi gen COL1A2. Tỷ lệ đột biến trên gen COL1A1 cao hơn gen COL1A2 và chủ yếu xảy ra trên exon: 83% với COL1A1 (hình 1.7). Dạng đột biến thường gặp là dạng thay đổi một acid amin này thành acid amin khác (do thay đổi một hoặc nhiều nucleotide trong bộ ba mã hóa acid amin), phá vỡ cấu trúc bộ ba Gly-X-Y dẫn đến mất tính bền vững của protein những dạng đột biến khác như mất hay thêm nucleotide hiếm gặp hơn.
Các đột biến thay thế Glycin (Gly) cũng như cấu trúc Gly-X-Y có vai trò quan trọng và thường là nguyên nhân gây rối loạn cấu trúc chuỗi helix alpha hay collagen I. Vùng mã hóa chuỗi này nằm trải dài từ exon 6 đến 49 của gen COL1A1. Như vậy, không chỉ các đột biến trong các exon mà ngay cả các đột biến nằm trong vùng intron xen giữa các exon từ 6 tới 49 cũng ảnh hưởng đến cấu trúc chuỗi helix. Thực tế đã chứng minh, 17% đột biến trên intron của gen COL1A1 được công bố gây bệnh OI (https://oi.gene.le.ac.uk).
Nhiều nghiên cứu cho thấy các trình tự đặc hiệu GGGGC, AG, GC thuộc vùng intron, nằm xung quanh vị trí 5’ tận và 3’ tận của một exon có vai
trò tạo liên kết với các phức hợp Protein-RNA (hnRNPs - Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins) để thực hiện quá trình cắt nối hoàn thiện mRNA. Hiện nay có 217 đột biến tại vùng intron của gen COL1A1 liên quan với các trình tự đặc hiệu GGGGC, AG, GC được công bố tại ngân hàng dữ liệu bệnh OI (Osteogenesis Imperfecta variant Database).
Phức hợp hnRNPs có vai trò quan trọng trong quá trình hoàn thiện mRNA; hnRNPs có hai nhiệm vụ chính. Thứ nhất, khi các protein giàu Serin/Arginin (SRs Protein) gắn vào các vùng tăng cường cắt nối trên exon của pre-mRNA (ESE: Exon Splicing Enhancer); các hnRNPs sẽ tìm đến những vùng tăng cường đặc hiệu trên intron (ISE: Intron Splicing Enhancer) [22]. Sự liên kết này tạo ái lực để các tiểu đơn vị spliceosome (U1snRNP, U2snRNP, U2AF65/35) khởi động quá trình cắt nối (Splicing process). Thứ hai, hnRNPs có thể gắn vào vùng ESE, nhằm đảm bảo mRNA được tổng hợp trong nhân tế bào sẽ được chuyển tới tế bào chất để bắt đầu quá trình dịch mã. hnRNPs được tái sử dụng sau khi chúng quay trở lại nhân (Hình 4.2).
Vai trò của các protein trên trong các bệnh lý di truyền cũng đã dần dần được làm sáng tỏ. Những bất thường trên vùng liên kết với các protein điều hoà quá trình cắt nối là nguyên nhân gây mất một hay nhiều exon, hoặc thêm một phần intron vào sản phẩm mRNA trước khi dịch mã.
Hình 4.1 : Vai trò của protein hnRNPs và SR trong quá trình hoàn thiện mRNA
SRs Protein: Protein giàu Serine/Arginine,
hnRNPs (Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins): phức hợp Protein-RNA,
các tiểu đơn vị hnRNPs: U1 liến kết vói nucleotide GU, U2 liến kết vói nucleotide A, AG,
ESE (Exon Splicing Enhancer): vùng tăng cường cắt nối trên exon của pre-mRNA ,
ISE (Intron Splicing Enhance): vùng tăng cường cắt nối đặc hiệu trên intron
Donor site: Vùng cho, Acceptor site: Vùng nhận
