Mẫu SPK ở nồng ựộ
(ộg/kg) 0,4 0,6 0,8
Lần Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 TB Ngày 1
Ngày 2
Ngày
3 TB Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 TB
Lần 1 0,34 0,34 0,36 0,35 0,49 0,33 0,42 0,41 0,83 0,98 0,57 0,79 Lần 2 0,25 0,39 0,29 0,31 0,64 0,33 0,54 0,50 0,99 1,03 0,72 0,91 Lần 3 0,21 0,39 0,28 0,29 0,31 0,40 0,43 0,38 0,71 0,95 0,76 0,81 Lần 4 0,25 0,18 0,27 0,23 0,37 0,43 0,50 0,43 0,75 1,07 0,70 0,84 Lần 5 0,40 0,16 0,32 0,29 0,24 0,32 0,52 0,36 0,74 0,50 0,66 0,63 Lần 6 0,28 0,19 0,44 0,30 0,40 0,28 0,67 0,45 0,92 0,61 0,63 0,72 Trung bình (ộg/kg) 0,29 0,28 0,33 0,30 0,41 0,35 0,51 0,42 0,82 0,86 0,67 0,78 SD 0,070 0,110 0,064 0,037 0,141 0,056 0,091 0,051 0,112 0,240 0,068 0,097 Hệ số biến thiên (CV%) 24,2 39,9 19,7 12,4 34,6 16,0 17,7 12,1 13,6 28,0 10,1 12,4 độ thu hồi (R%) 72,1 68,8 81,7 74,2 68,1 58,1 85,6 70,6 102,9 107,1 84,2 98,1 Trung bình chung (ộg/kg) 0,30 0,42 0,78 SD chung 0,082 0,119 0,169
Hệ số biến thiên chung
(CV%) 27,6 28,1 21,6
độ thu hồi chung (R%) 74,2 70,6 98,1
Kết luận đạt đạt đạt
Kết quả bảng 3.7 cho thấy: Phép thử phân tắch dư lượng clenbuterol trong mẫu thịt tươi thêm chuẩn,
- Ở nồng ựộ 0,4ộg/kg, lập lại 3 ngày khác nhau, ựộ thu hồi chung (R%) là 74,2 %, hệ số biến thiên chung là 27,6%. Kết quả này chấp nhận ựược theo quyết ựịnh 657/EC/2002 ở ngưỡng ≤1 ộg/kg.
- Ở nồng ựộ 0,6ộg/kg, lập lại 3 ngày khác nhau, ựộ thu hồi chung (R%) là 70,6 %, hệ số biến thiên chung là 28,1%. Kết quả này chấp nhận ựược theo quyết ựịnh 657/EC/2002 ở ngưỡng ≤1 ộg/kg.
- Ở nồng ựộ 0,8ộg/kg, lập lại 3 ngày khác nhau, ựộ thu hồi chung (R%) là 98,1 %, hệ số biến thiên chung là 21,6%. Kết quả này chấp nhận ựược theo quyết ựịnh 657/EC/2002 ở ngưỡng ≤1 ộg/kg.
(ộg/kg)
Lần Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 TB Ngày 1
Ngày 2
Ngày
3 TB Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 TB
Lần 1 0,28 0,37 0,23 0,29 0,55 0,32 0,33 0,40 0,78 1,00 0,67 0,82 Lần 2 0,21 0,30 0,31 0,27 0,51 0,27 0,38 0,39 0,80 0,84 0,62 0,75 Lần 3 0,26 0,34 0,31 0,30 0,23 0,42 0,32 0,32 0,89 0,32 0,86 0,69 Lần 4 0,30 0,24 0,22 0,25 0,20 0,37 0,32 0,30 0,84 1,10 0,79 0,91 Lần 5 0,24 0,28 0,32 0,28 0,24 0,25 0,39 0,29 0,90 0,75 0,61 0,75 Lần 6 0,28 0,38 0,45 0,37 0,28 0,29 0,32 0,30 0,90 0,86 0,88 0,88 Trung bình (ộg/kg) 0,26 0,32 0,31 0,30 0,34 0,32 0,34 0,33 0,85 0,81 0,74 0,80 SD 0,033 0,055 0,083 0,040 0,154 0,064 0,033 0,048 0,053 0,271 0,121 0,084 Hệ số biến thiên (CV%) 12,4 17,1 26,9 13,6 45,9 20,2 9,5 14,5 6,2 33,4 16,3 10,5 độ thu hồi (R%) 65,4 79,6 76,7 73,9 55,8 53,3 57,2 55,5 106,5 101,5 92,3 100,1 Trung bình chung (ộg/kg) 0,30 0,33 0,80 SD chung 0,062 0,093 0,170
Hệ số biến thiên chung
(CV%) 20,9 27,8 21,3
độ thu hồi chung (R%) 73,9 55,5 100,1
Kết luận đạt đạt đạt
Kết quả bảng 3.8 cho thấy: Phép thử phân tắch dư lượng salbutamol trong mẫu thịt tươi thêm chuẩn,
- Ở nồng ựộ 0,4ộg/kg, lập lại 3 ngày khác nhau, ựộ thu hồi chung (R%) là 73,9 %, hệ số biến thiên chung là 20,9%. Kết quả này chấp nhận ựược theo quyết ựịnh 657/EC/2002 ở ngưỡng ≤1 ộg/kg.
- Ở nồng ựộ 0,6ộg/kg, lập lại 3 ngày khác nhau, ựộ thu hồi chung (R%) là 55,5 %, hệ số biến thiên chung là 27,8%. Kết quả này chấp nhận ựược theo quyết ựịnh 657/EC/2002 ở ngưỡng ≤1 ộg/kg.
- Ở nồng ựộ 0,8ộg/kg, lập lại 3 ngày khác nhau, ựộ thu hồi chung (R%) là 100,1 %, hệ số biến thiên chung là 21,3%. Kết quả này chấp nhận ựược theo quyết ựịnh 657/EC/2002 ở ngưỡng ≤1 ộg/kg.
Ghi chú: Yêu cầu theo quyết ựịnh 657/EC/2002 ở ngưỡng ≤1 ộg/kg: độ thu hồi là (R%) là 50 Ờ 120%; Hệ số biến thiên (CV%) là ≤ 30%. Dựa vào số liệu phê duyệt của phương pháp, kết quả tắnh độ không ựảm bảo ựo thu ựược kết quả như bảng 3.9 sau:
3.1.2.6. Kết quả tắnh ựộ không ựảm bảo ựo của phương pháp phân tắch dư lượng salbutamol và clenbuterol trong thịt lợn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Clenbuterol Salbutamol
Tắnh chung Tắnh chung
Nồng ựộ spike ((ộg/kg) 0,4 0,6 0,8 0,4 0,6 0,8
Tắn hiệu ựo ựược ((ộg/kg) 0,30 0,42 0,78 0,30 0,33 0,80
độ tự do (n-1) 17 17 17 17 17 17
độ lệch chuẩn (SD) 0,08 0,12 0,17 0,06 0,09 0,17
Hệ số biến thiên (CV%) 27,6 28,1 21,6 20,9 27,8 21,3
Phương sai chung cùng nồng ựộ 129,302 134,032 79,214 342,548 74,462 131,804 77,033 283,298
Tổng ựộ tự do (n-1) 51 51
Hệ số biến thiên chung (CV%) 0,1 0,1
Hệ số biến thiên kết hợp (CV%) 25,9 23,6
độ không ựảm bảo ựo
Phương sai kết hợp 0,07 0,06
Hệ số biến thiên kết hợp (CV%) 25,9 23,6
Hệ số phủ 2 2
3.1.2.7. Kết quả nghiên cứu ựảm bảo chất lượng phép thử * Kiểm tra ô nhiễm của hệ thống máy
Trước khi chạy mẫu, bơm dung môi ACN ựể kiểm tra sự ổn ựịnh và tạp nhiễm của máy.
*Kiểm tra sự nhiễm bẩn sau khi bơm loạt mẫu
Cứ sau khi bơm một loạt 10 mẫu, bơm 01 mẫu ACN. Kết quả máy không bị nhiễm bẩn từ những lần chạy máy trước thì mới ựược bơm mẫu tiếp, nếu không thì phải ựiều chỉnh chương trình chạy mẫu và rửa kim.
*Kiểm tra mẫu mù
Bố trắ: Sử dụng mẫu trắng và mẫu dương tắnh với salbutamol, clenbuterol, nồng ựộ ựã ựược xác ựịnh. Mỗi loại cân 01 mẫu; người khác chuẩn bị mẫu ựể người phân tắch mẫu không ựược biết thông tin về mẫu. Tất cả các mẫu ựều thêm nội chuẩn salbutamol, clenbuterol ở nồng ựộ 1ppb. Chuẩn bị mẫu và phân tắch mẫu theo quy trình nói trên. Kết quả như sau:
Bảng 3.10. Kết quả kiểm tra mẫu mù
Phân tắch ựịnh tắnh Phân tắch ựịnh lượng (ộg/kg) Loại
mẫu CLE CLE-d9 SAL SAL-d3 CLE CLE-d9 SAL SAL-d3
Mẫu trắng - + - + - 0,82 - 0,72 Mẫu dương tắnh + + + + 0,36 0,76 0,53 0,68 Ghi chú : CLE: Clenbuterol
CLE-d9: Nội chuẩn Clenbuterol SAL: Salbutamol
SAL-d3: Nội chuẩn Salbutamol (-) : Âm tắnh;
Kết quả bảng 3.10 trên cho thấy:
+ Kết quả phân tắch ựịnh tắnh: Mẫu trắng cho kết quả âm tắnh ựối với từng chất salbutamol, clenbuterol; mẫu dương tắnh cho kết quả dương tắnh trong phân tắch ựịnh tắnh. Kết quả này phù hợp với thắ nghiệm ựược bố trắ.
+ Kết quả phân tắch ựịnh lượng: Mẫu ựịnh tắnh cho kết quả dương tắnh ựược ựưa vào ựịnh lượng và ựược kiểm soát bằng nội chuẩn. độ thu hồi của từng nội chuẩn salbutamol-d3, clenbuterol-d9 trong mẫu là ựều ựạt yêu cầu so với quy ựịnh trong quyết ựịnh 657/EC/2002 (yêu cầu ựộ thu hồi ựạt 50 Ờ 120% khi chuẩn thêm vào ở ngưỡng ≤1,0 ộg/kg). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phương pháp khẳng ựịnh và ựịnh lượng Beta-agonists (salbutamol và clenbuterol) trong thịt lợn bằng sắc ký lỏng phổ khối bằng LCMSMS do phòng thắ nghiệm lập dựng lên trên cơ sở tham khảo các bài báo khoa học, quy trình chuyển giao của PTN tham chiếu của Pháp về phân tắch chất tồn dư trong thực phẩm (SARAF); sự hợp tác và giúp ựỡ trực tiếp của các chuyên gia sắc ký lỏng phổ khối dày dặn kinh nghiệm về ựiều kiện sắc ký và phổ khối... Phương pháp ựã ựược kiểm tra và chuẩn hóa về khoảng tuyến tắnh, giới hạn phát hiện, giới hạn ựịnh lượng, giới hạn quyết ựịnh và khả năng phát hiện, ựộ thu hồi. Phương pháp là phù hợp ựể phân tắch khẳng ựịnh và ựịnh lượng dư lượng β-agonist trong thịt lợn theo quy ựịnh trong quyết ựịnh 657/2002/EC.
3.2.Khảo sát thực hành kinh doanh thịt lợn và áp dụng phương pháp ựể phân tắch mẫu thực tế
3.2.1. Kết quả ựiều tra các yếu tố liên quan ựến thực hành kinh doanh thịt lợn
Mẫu thịt lợn ựược lấy tại các cơ sở kinh doanh thịt lợn trên ựịa bàn 6 tỉnh: Phú Thọ, Nam định, Hà Nam, Hải Phòng, Quảng Ninh, Thái Bình. Kết quả ựiều tra các yếu tố liên quan ựến thực hành kinh doanh thịt lợn (bảng 3.11)
Bảng 3.11. Kết quả ựiều tra các yếu tố liên quan ựến thực hành kinh doanh thịt lợn STT Chỉ tiêu Tần số (n) Tỷ lệ (%) Nữ 114 84,4 1 Giới tắnh Nam 21 15,6 Có 7 5,2
2 Tập huấn kinh doanh thịt
Không 128 94,8 <=30 20 14,8 30-50 99 73,3 3 Tuổi >50 16 11,9 <=5 20 14,8 5-20 91 67,4
4 Số năm kinh nghiệm
>20 24 17,8 50-100 96 71,1 100-200 36 26,7 5 Khối lượng thịt bán hàng ngày (kg/ngày) >200 3 2,2 Nơi tập trung 57 42,2 6 Nơi giết mổ Hộ gia ựình 78 57,8
Kết quả bảng 3.11 cho thấy:
Trong số 135 phiếu ựiều tra, ựối tượng tham gia bán thịt phần lớn là phụ nữ (chiếm 84,4%) và một số ắt là nam giới (chiếm 15,6%). điều này phù hợp với sự phân công lao ựộng của xã hội, với sức khoẻ của người phụ nữ. Và hầu hết người bán thịt không tham gia khoá tập huấn về thực hành kinh doanh thịt (chiếm 94,8%). Chỉ một số ắt ựã từng tham gia khoá học tập huấn (chiếm 5,2%). Việc có tham gia khoá học tập huấn về kinh doanh thịt hay không phụ thuộc vào yếu tố chủ quan hay khách quan của người bán thịt. Do không có ựiều kiện ựể học hay do không nhận thức ựược tầm quan trọng của việc học tập huấn.
Phần lớn người bán thịt có ựộ tuổi từ 30-50 tuổi, chiếm tỷ lệ 73,3%. Số người có ựộ tuổi <30 tuổi và trên 50 tuổi chiếm tỷ lệ nhỏ (tương ứng là 14,8% và 11,9%).
Về kinh nghiệm của người bán thịt, tỷ lệ người bán thịt có số năm kinh nghiệm từ 5-20 năm chiếm 61,5%, người bán thịt có số năm kinh nghiệm dưới 5 năm và trên 20 năm chiếm tỷ lệ ắt tương ứng là 14,8%, 17,8%.
Khối lượng thịt bán ra hàng ngày tại các cửa hàng có sự chênh lệch lớn. Trung bình lượng thịt bán ra hàng ngày từ 50-100kg chiếm tỷ lệ lớn (71,1%), sau ựó ựến các cửa hàng có lượng thịt bán ra từ 100-200kg chiếm 26,7% và rất ắt cửa hàng có lượng thịt bán ra trên 200kg (chiếm tỷ lệ 2,2%). điều này có thể giải thắch do nhu cầu tiêu thụ thịt của từng khu vực là khác nhau.
Nơi giết mổ gia súc, phần lớn lợn ựược giết mổ tại các hộ gia ựình chiếm tỷ lệ 57,8%, tại nơi tập trung ựể giết mổ chiếm 42,2%. Sở dĩ như vậy là do ảnh hưởng của cơ chế thị trường, việc giết mổ, kinh doanh thịt phát triển còn tự phát. Ở hầu hết các tỉnh, việc giết mổ ựược thực hiện tại các gia ựình thu gom và kinh doanh lợn thịt, hoặc ngay tại các hộ bán gia súc. Các cơ sở giết mổ ựơn thuần chỉ là nơi tập trung ựộng vật ựể giết mổ, cơ sở vật chất còn nghèo nàn, lạc hậu, không có hệ thống giá ựỡ ựể giết mổ treo, nơi thực hiện việc giết mổ chưa phân thành khu bẩn và sạch riêng biệt. đại ựa số thực phẩm ựang lưu thông, kinh doanh trên thị trường không ựược sự kiểm tra, kiểm soát của các cơ quan chức năng. Người kinh doanh, giết mổ, buôn bán sản phẩm ựộng vật tại các quầy, hàng lẻ ý thức chấp hành vệ sinh an toàn thực phẩm chưa cao, ựôi khi lưu hành các loại sản phẩm ựộng vật kém chất lượng hoặc không rõ nguồn gốc. Màng lưới kiểm soát viên còn quá mỏng, không kiểm tra hết sản phẩm ựộng vật bán tại các chợ, phương tiện kiểm tra chưa có tắnh thuyết phục, chủ yếu là cảm quan, theo kinh nghiệm. Chắnh vì vậy, việc truy nguyên nguồn gốc các vụ ngộ ựộc rất khó khăn và ựây cũng là nguyên nhân gây lây lan dịch bệnh. Vì vậy lợn ựược giết mổ tại các lò tập trung chiếm tỷ lệ ắt (42,2%), tại các hộ gia ựình vẫn chiếm một tỷ lệ quá 50%.
3.2.2. Kết quả phân tắch dư lượng β-agonists trong mẫu thịt lợn bằng kỹ thuật ELISA
Kết quả kiểm tra ựược trình bày ở bảng 3.12
Bảng 3.12. Kết quả phân tắch dư lượng β-agonists trong mẫu thịt lợn bằng kỹ thuật ELISA
Số mẫu kiểm tra Số mẫu (+)/ nghi ngờ Tỷ lệ (%)
135 15 11,1
Kết quả trình bày ở bảng 3.12 cho thấy: trong số 135 mẫu thịt lợn ựược kiểm tra thấy có 15 mẫu thịt nghi ngờ nhiễm β-agonists, chiếm tỷ lệ 11,1%.
Biểu thị tỷ lệ % mẫu thịt nghi ngờ nhiễm β-agonists bằng kỹ thuật ELISA (biểu ựồ 3. 1)
Biểu ựồ 3.1. Tỷ lệ % mẫu thịt nghi ngờ nhiễm β-agonists bằng Kỹ thuật ELISA.
ELISA là kỹ thuật sàng lọc hiệu quả ựể loại bỏ các mẫu âm tắnh. Ưu ựiểm của kỹ thuật này là ựộ nhạy cao, có khả năng phát hiện ựược dư lượng chất cần phân tắch ở nồng ựộ nhỏ, phân tắch ựược nhiều mẫu trong cùng một thời gian và không bỏ sót mẫu dương tắnh. đây là kỹ thuật ựược áp dụng phổ biến ở các phòng thử nghiệm phân tắch dư lượng trong thực phẩm ở nhiều nước trên thế giới. Tuy nhiên, phương pháp còn có một số nhược ựiểm như tắnh ựặc hiệu không cao, còn một tỷ lệ phản ứng chéo với những chất có cấu trúc hoặc ựặc tắnh tương tự vì các
chất ựại diện trong khung sinh học có thể giao thoa trong phản ứng kháng nguyên - kháng thể.
Mặc dù có mặt hạn chế như vậy, nhưng kỹ thuật ELISA vẫn là một công cụ hữu ắch ựể phân tắch nhanh dư lượng trong thực phẩm có nguồn gốc ựộng vật. Kết quả phân tắch sẽ cung cấp các thông tin rất hữu ắch, kinh tế cho công việc phân tắch tiếp theo.
3.2.3. Kết quả phân tắch dư lượng β-agonists (salbutamol, clenbuterol) trong mẫu thịt lợn bằng kỹ thuật LCMSMS
Sau khi, các mẫu thịt ựược phân tắch sàng lọc bằng phương pháp Elisa. Tiếp theo, các mẫu có kết quả dương tắnh ựó ựược phân tắch khẳng ựịnh và ựịnh lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC/MS/MS) theo quy trình ựã ựược chuẩn hóa. Kết quả ựược trình bày ở bảng 3.13
Bảng 3.13. Kết quả phân tắch dư lượng β-agonists (Salbutamol, clenbuterol) trong mẫu thịt lợn bằng kỹ thuật LCMSMS
Salbutamol Clenbuterol STT Số mẫu kiểm tra ổ bằng ELISA Số mẫu (+) Hàm lượng (ộg/kg) Số mẫu (+) Hàm lượng (ộg/kg) 15 3 1,25-5,65 8 0,25-1,43 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả phân tắch bảng 3.13 cho thấy: trong số 15 mẫu thịt lợn mẫu thịt nghi ngờ nhiễm β-agonists bằng kỹ thuật ELISA, sau ựó ựược phân tắch khẳng ựịnh bằng kỹ thuật LCMSMS ựã khẳng ựịnh 8 mẫu thịt nhiễm Clenbuterol với hàm lượng 0,25-1,43 ộg/kg; 3 mẫu nhiễm Salbutamol với hàm lượng 1,25-5,65 ộg/kg.
Sau khi phân tắch khẳng ựịnh, tiến hành ựánh giá tỷ lệ % mẫu thịt nhiễm β- agonists (salbutamol, clenbuterol) trong mẫu thịt lợn khảo sát. Kết quả ựược thể hiện ở biểu ựồ 3. 2
Salbutamol (%) Clenbuterol (%) S1 2.2 5.9 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0
Biểu ựồ 3. 2. Tỷ lệ % mẫu thịt lợn bị nhiễm salbutamol, clenbuterol
Kỹ thuật LCMSMS ựòi hỏi chi phắ ựầu tư lớn, ựòi hỏi chuyên gia nhưng có rất nhiều ưu ựiểm như ựộ nhạy cao, ựộ ựặc hiệu cao, có khả năng khẳng ựịnh và ựịnh lượng chất phân tắch với ựộ tin cậy cao. Hiện nay, lĩnh vực hoá học, hoá dầu, công nghệ thực phẩm, nông nghiệp, thuốc trừ sâu, y học lâm sàng, công nghệ dược phẩm Ầựã và ựang áp dụng kỹ thuật LCMSMS trong phân tắch.
Bằng phương pháp sàng lọc ELISA ựã phát hiện thấy 15/135 mẫu thịt lợn nhiễm nhóm β-agonists nhưng khi ựem khẳng ựịnh và ựịnh lượng bằng phương pháp LCMSMS thì chỉ có 08 trong số 15 mẫu thịt phát hiện thấy có chứa clenbuterol và 03 mẫu trong số 15 mẫu thịt phát hiện thấy có chứa salbutamol. điều này có thể là ựộ ựặc thù của phương pháp ELISA chưa cao (Gentaur, 2007) hoặc cũng có thể là trong mẫu thịt còn có chất khác thuộc nhóm β-agonists cũng có phản ứng ựặc hiệu. Kết quả này là chấp nhận ựược vì theo protocol của nhà sản xuất, ngoài salbutamol và clenbuterol, kit còn có phản ứng ựặc hiệu ở mức cao (≥70%) với nhiều chất khác của nhóm β-agonists như bitolterol, carbuterol, colterol.
Hơn nữa, các bước phân tắch mẫu tuân thủ theo hướng dẫn của nhà sản xuất