Thành phần Ion sơ cấp
(m/z)
Ion thứ cấp
(m/z) Cone (V) Coll (eV)
Clenbuterol 277,1 202,7 259,7 20 15 11 Clenbuterol-d9 286,0 204,1 20 19 Salbutamol 240,2 148,1 221,8 20 19 11 Salbutamol-d3 286,0 204,1 20 19 Các thông số cần xác ựịnh:
Ớ Tắnh ựặc hiệu/chọn lọc là khả năng phân biệt chất cần phân tắch với các
chất khác. Trong kỹ thuật sắc ký khối phổ, yêu cầu ựiểm nhận dạng (IP) phải ≥ 4 (tối thiểu phải có ion mẹ là 1 ựiểm, 2 ion con, mỗi ion là 1,5 ựiểm).
Ớ Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn ựịnh lượng (LOQ)
Thêm dung dịch chuẩn salbutamol, clenbuterol vào mẫu thịt (mẫu trắng) sao cho hàm lượng các chất có trong mẫu khá nhỏ.
Giới hạn ựịnh lượng (LoQ) ựược tắnh theo công thức: LoQ = 3 x LoD Ớ Giới hạn quyết ựịnh (CCα) và khả năng phát hiện (CCβ)
Giới hạn quyết ựịnh (CCα) là nồng ựộ nhỏ nhất của chất phân tắch trong mẫu mà phương pháp ựưa ra kết luận là mẫu dương tắnh khi xác suất lỗi dương tắnh giả α = 1%.
Khả năng phát hiện (CCβ) là nồng ựộ thấp nhất của chất phân tắch trong mẫu mà phương pháp có thể phát hiện ựược khi xác suất lỗi âm tắnh giả β = 5%.
Ớ Xác ựịnh ựộ tuyến tắnh
độ tuyến tắnh của phương pháp phân tắch là khoảng nồng ựộ chất phân tắch có trong mẫu mà phương pháp phân tắch có thể ựạt ựược kết quả thử nghiệm tỷ lệ thuận với nồng ựộ chất phân tắch có trong mẫu.
Chuẩn bị mẫu trắng thêm chuẩn ở ắt nhất 5 nồng ựộ khác nhau, trong khoảng tuyến tắnh ước lượng ở trên. Chuẩn bị mẫu theo quy trình phân tắch và ựo trên thiết bị LCMSMS. Chương trình phần mềm của thiết bị sẽ tự lập phương trình tuyến tắnh y = ax + b. Tiêu chắ chấp nhận: hệ số hồi quy 0,99 ≤ R2 ≤1.
Ớ độ thu hồi (%): Tắnh bằng tỷ lệ % hàm lượng chất phân tắch ựo ựược thực
tế từ mẫu trắng thêm chuẩn so với nồng ựộ cho vào.
Ớ độ chụm: Biểu thị sự biến ựộng giữa các phép thử lập lại, ựược ựo bằng
ựộ lệch chuẩn (EUROCHEM) (EU, 2002 ; European Commission, 2003). độ chụm bao gồm:
+ độ lập lại: độ lập lại ựánh giá mức ựộ biến ựộng của kết quả thử nghiệm ựược thực hiện bởi cùng một người trong cùng phòng thử nghiệm. đánh giá ựộ lặp lại của phép thử thường thực hiện trên mẫu trắng thêm chuẩn vào ở 3 ngưỡng nồng ựộ 1x, 1,5x, 2x MRPL, mỗi nồng ựộ ựược kiểm nghiệm lập lại 6 lần.
+ độ chụm trung gian (SR): độ chụm trung gian diễn tả mức ựộ biến ựộng trong phạm vi phòng thử nghiệm thực hiện trong các ngày/ người phân tắch khác nhau. Tuy nhiên, không cần thiết nghiên cứu riêng rẽ sự ảnh hưởng của từng nhân tố. để ựánh giá ựộ chụm trung gian của phép thử, phép thử ựược thực hiện trên mẫu trắng thêm chất chuẩn ở 3 nồng ựộ khác nhau (1x, 1,5x, 2x MRPL), mỗi nồng ựộ ựược kiểm nghiệm 6 lần, thực hiện 3 ngày khác nhau. Tắnh giá trị ựộ lệch chuẩn tương ựối tổng RSDR ở mỗi nồng ựộ phân tắch; so sánh với quy ựịnh trong quyết ựịnh 657/2002/EC ựể ựánh giá.
Ghi chú: Trong các phòng thắ nghiệm, thường kết hợp các thắ nghiệm ựể xác ựịnh ựộ thu hồi, ựộ lập lại, ựộ chụm trung gian (SR). Trên cơ sở số liệu chuẩn hóa ựể xác ựịnh ựộ thu hồi, ựộ chụm có thể bố trắ ở 3 nồng ựộ khác nhau không nhất thiết là 1x, 1,5x, 2x MRPL
+ độ không ựảm bảo ựo của phương pháp:
Là thông số gắn với kết quả của phép ựo, thông số này ựặc trưng cho mức ựộ phân tán của các giá trị có thể chấp nhận ựược quy cho ựại lượng ựo của phép ựo.
thiên ở mỗi nồng ựộ phân tắch; Tắnh hệ số biến thiên ở các nồng ựộ phân tắch. độ không ựảm bảo ựo ựược tắnh theo công thức sau: uR (%) =tα,k x CVR(%)
Trong ựó: UR : độ không ựảm bảo ựo tổng CVR : Hệ số biến thiên
tα,k : giá trị-student tra bảng với mức ý nghĩa α= 0,05 k : Bậc tự do (k = n -1)
Chương 2
đỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.Vật liệu nghiên cứu
2.1.1.đối tượng nghiên cứu
Chất kắch thắch tăng trưởng β-agonists (clenbuterol và salbutamol) ô nhiễm trong thịt lợn.
2.1.2. địa ựiểm nghiên cứu
- địa ựiểm thắ nghiệm: Phòng thắ nghiệm của Trung tâm Kiểm tra vệ sinh thú y TƯ1 - Cục Thú y (VILAS 059, ISO 17025: 2005).
- địa ựiểm ựiều tra và lấy mẫu: Thịt lợn bày bán tại chợ ở 06 tỉnh miền Bắc (Phú Thọ, Hải Phòng, Nam định, Hà Nam, Thái Bình, Quảng Ninh).
2.1.3. Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 10 năm 2012 ựến tháng 10 năm 2013.
2.1.4. Hóa chất và thuốc thử:
2.1.4.1. Hóa chất và thuốc thử dùng cho phân tắch ựịnh tắnh
- Bộ kắt β-agonists (MaxSignalTM, hãng BIOO-SCIENTIFIC, mã 1009)
2.1.4.2. Hóa chất và thuốc thử dùng cho phân tắch ựịnh lượng
Hoá chất và thuốc thử phải ựạt tiêu chuẩn tinh khiết cấp ựộ LCMS, bao gồm: Ớ Hóa chất:
Chất chuẩn salbutamol, clenbuterol và chuẩn nội salbutamol-d3, clenbuterol- d9 (hãng Dr. Ehrenstorfer);
Nước tinh khiết LCMS, Methanol tinh khiết LCMS; Acetonitrile tinh khiết LCMS (hãng Merck).
Cột chiết pha rắn C18 (MCX-OASIS); Các loại hóa chất loại dùng cho phân tắch như n-hexan, natri acetate, acid acetic, amonium hydroxyde, amoniac, acid acetic...
Ớ Dung dịch và dung môi:
- Chuẩn bị dung dịch Natri acetate 0,2M: Cân 2,722 g natri acetate hòa tan vào trong 100ml nước cất.
-Chuẩn bị dung dịch amonium hydroxyde 5% amoniac/ acetonitril:
- Chuẩn bị dung dịch: ethylacetate : acetonitril : amonium hydroxyde 32% (90:10:5)
- Chuẩn bị dung dịch: Nước cất / acetonitril (90/10)
- Acid acetic 1 M: Hút 5,7 ml acid acetic hòa tan vào 100 ml nước cất. - Chuẩn bị dung môi pha ựộng:
Pha ựộng A: Acetonitrile + 0,1% formic acid
Pha ựộng B: Nước cất tinh khiết + 0,1% formic acid Ớ Chuẩn bị dung dịch chuẩn và nội chuẩn
* Chuẩn bị dung dịch chuẩn salbutamol, clenbuterol:
- Dung dịch chuẩn gốc 1000 ộg/mL: Cân chắnh xác 10 mg chuẩn mỗi loại salbutamol, clenbuterol, hoà tan và ựịnh mức tới 10 mL bằng methanol. Dung dịch chuẩn ựược bảo quản trong tủ lạnh 3 tháng.
- Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 1 ộg/mL: 50 ộl dung dịch chuẩn gốc 1000 ộg/mL mỗi loại, ựịnh mức tới 50 mL bằng methanol. Dung dịch chuẩn ựược bảo quản trong tủ lạnh 1 tháng .
- Dung dịch chuẩn hỗn hợp cho vào mẫu 100 ng/mL: 100 ộL dung dịch chuẩn trung gian 10 ộg/mL mỗi loại, ựịnh mức tới 10 mL bằng methanol. Dung dịch này ựược chuẩn bị hàng ngày.
* Chuẩn bị dung dịch nội chuẩn: clenbuterol Ờd9 và salbutamol Ờd3
- Dung dịch nội chuẩn gốc 100 ộg/mL;
- Dung dịch nội chuẩn trung gian hỗn hợp 1 ộg/mL: 100 ộL dung dịch chuẩn gốc 100 ộg/mL mỗi loại, ựịnh mức tới 10 ml bằng methanol. Dung dịch ựược bảo quản trong tủ lạnh 1 tháng;
- Dung dịch nội chuẩn làm việc hỗn hợp 10 ng/mL: 100 ộL dung dịch chuẩn trung gian 1ộg/mL mỗi loại, ựịnh mức tới 10 mL bằng methanol. Dung dịch này ựược ựược chuẩn bị hàng tuần.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc tinh khiết: Dung dịch chuẩn làm việc tinh khiết, chuẩn bị hàng tuần (bảng 2.1):