Nồng ựộ (ộộộộg/mL) Thể tắch chuẩn hỗn hợp làm việc 100 ng/mL (ộL) Thể tắch chuẩn hỗn hợp trung gian 1 ộg/mL (ộL) Thể tắch Nội chuẩn hỗn hợp làm việc 10 ng/mL (ộL) 0 0 0 50 0,2 10 0 50 0,6 30 0 50 1,8 90 0 50 5,4 0 27 50 16,2 0 81 50 2.1.5. Thiết bị và dụng cụ thắ nghiệm
- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ UPLC Ờ xevo TQMS (hãng Waters). - Hệ thống ELISA (hãng BIO - TEX);
- Các thiết bị phụ trợ cho việc chuẩn bị mẫu như máy lắc vortex, máy ựồng nhất mẫu, máy bay hơi nitơ kèm bể ựiều nhiệt 24 lỗ giếng, máy li tâm MIKRO 22R...Các dụng cụ như micropipette 1 kênh và 8 kênh, ống nghiệm ly tâm, ống ựong, kéo, găng tayẦ
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Nội dung 1: Chuẩn hóa phương pháp phân tắch ựịnh tắnh xác ựịnh dư lượng β-agonists trong thịt bằng kỹ thuật ELISA;
Nội dung 2: Chuẩn hóa phương pháp phân tắch ựịnh lượng xác ựịnh dư lượng β-agonists trong thịt bằng kỹ thuật LCMSMS;
- Nội dung 3. Ứng dụng các phương pháp ựã chuẩn hóa ựể phân tắch dư lượng β-agonists trong thịt ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam.
2.3.Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Thắ nghiệm 1: Tạo mẫu thịt âm tắnh và dương tắnh với β-agonists.
động vật thắ nghiệm là lợn choai, có nguồn gốc tin tưởng, rõ ràng, chưa bao giờ nuôi bằng thức ăn công nghiệp, chưa bao giờ cho sử dụng thuốc thú y, ựặc biệt
là thuốc thú y có thể nhiễm β-agonists. Bố trắ thắ nghiệm:
Lô 1 (lô ựối chứng âm): 1 lợn ựược nuôi bằng thức ăn không có β-agonists. Tiến hành theo dõi, chăn sóc liên tục trong 3 tuần. Giết thịt thu mẫu. Mẫu thịt thu từ lô này là mẫu âm tắnh, ựể tạo mẫu thêm chuẩn và nội chuẩn β-agonists (salbutamol, clenbuterol) vào;
Lô 2 (lô ựối chứng dương salbutamol): 1 lợn ựược nuôi bằng thức ăn có salbutamol với hàm lượng 0,5 mg/kg thức ăn, liên tục trong 10 ngày. Giết thịt thu mẫu thịt.
Lô 3 (lô ựối chứng dương clenbuterol): 1 lợn ựược nuôi bằng thức ăn có clenbuterol với hàm lượng 0,5 mg/kg thức ăn, liên tục trong 10 ngày. Giết thịt thu mẫu.
- Bảo quản mẫu thử:
Mẫu thịt tươi bảo quản ở nhiệt ựộ 0-4oC không quá 1 tuần;
Mẫu thịt ựông lạnh bảo quản ở nhiệt ựộ < -18oC không quá 6 tháng. Khi giải ựông cần giải ựông ở nhiệt ựộ lạnh.
2.3.2. Thắ nghiệm 2. Thắ nghiệm chuẩn hóa phương pháp ựịnh tắnh β-agonist trong thịt lợn bằng kỹ thuật ELISA
Thắ nghiệm 2.1. Kiểm tra tắnh ổn ựịnh của kắt
Xây dựng ựường chuẩn β-agonists của kắt theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Thắ nghiệm lập lại 5 lần trên 5 bộ kắt thuộc 5 lô vào 5 ngày khác nhau. Lập lại thắ nghiệm này với phần còn lại của bộ kắt ựược bảo quản theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Trên cơ sở ựó, xây dựng phương trình hồi quy tuyến tắnh y = ax + b và ựánh giá về sự chấp nhận của phương trình. Dùng thử nghiệm thống kê t-student và thử nghiệm F ựể xác ựịnh tắnh hợp lý của phương trình hồi quy tuyến tắnh. Yêu cầu phương trình có hệ số hồi quy R2>0,99.
Thắ nghiệm 2.2. Xác ựịnh ựộ chắnh xác (AC), ựộ ựặc hiệu (SP), ựộ nhạy (SE), ựộ lệch dương (PD) và ựộ lệch âm (ND).
Bố trắ như sau: Chuẩn bị hai nhóm mẫu, mỗi nhóm 20 mẫu, trong ựó có một nhóm mẫu trắng và một nhóm mẫu thêm chuẩn ở nồng ựộ 1ppb (khoảng bằng 10 lần LOD = 0,1ppb). Cụ thể như sau:
Cân 3,0g ổ 0,1g mẫu thịt lô 1 ựã ựược ựồng nhất, cho vào ống ly tâm. Thêm 30ộl dung dịch chuẩn β-agonists 100 ppb ựể yên 15 phút. Sau ựó tiến hành chiết và làm sạch mẫu theo quy trình của nhà sản xuất. đọc kết quả và tắnh kết quả theo các công thức sau:
Kết quả Mẫu chứng (+) Mẫu chứng (-)
Mẫu có kết quả dương tắnh (+) TP FP
Mẫu có kết quả âm tắnh (-) FN TN
Trong ựó:
TP (True Positive): Dương tắnh ựúng (Mẫu chứng có kết quả dương tắnh, kết quả phân tắch cho kết quả dương tắnh)
FP (False Positive): Dương tắnh giả (Mẫu chứng có kết quả âm tắnh, kết quả phân tắch cho kết quả dương tắnh)
FN (False Negative): Âm tắnh giả (Mẫu chứng có kết quả dương tắnh, kết quả phân tắch cho kết quả âm tắnh)
TN (True Negative): Âm tắnh ựúng (Mẫu chứng có kết quả âm tắnh, kết quả phân tắch cho kết quả âm tắnh) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
N = TP + FP + FN +TN: Tổng số các kết quả Công thức tắnh như sau:
đánh giá kết quả theo quyết ựịnh 657/2002/EC: Ớ độ chắnh xác (AC) ≥90 % Ớ độ ựặc hiệu (SP) ≥90 % Ớ độ nhạy (SE) ≥90 % Ớ độ lệch dương (PD) ≤10 % Ớ độ lệch âm (ND) ≤10 %
Thắ nghiệm 2.3. Xác ựịnh khả năng phát hiện (CCβ)
Theo hướng dẫn của 657/2002/EC, việc xác ựịnh khả năng phát hiện (CCβ) xác suất lỗi âm tắnh giả là β=5% của phương pháp bằng cách:
Bước 1. Chuẩn bị 20 mẫu trắng và 20 mẫu thêm chuẩn ở nồng ựộ xác ựịnh (không quá MRPL).
Bước 2. Phân tắch các mẫu trên theo quy trình phân tắch.
Bước 3. Xác ựịnh giá trị Ộcut offỢ phải ựáp ứng yêu cầu: giá trị lớn nhất của mẫu trắng phải không vượt quá giá trị nhỏ nhất của mẫu thêm chuẩn.
Bước 4. kết luận giá trị CCβ (có ≤ 5% số mẫu thêm chuẩn có giá trị ≤ giá trị Ổcut Ờ offỖ thì nồng ựộ thêm chuẩn ở nồng ựộ xác ựịnh trong thắ nghiệm này coi là CCβ).
2.3.3. Thắ nghiệm 3. Thắ nghiệm chuẩn hóa phương pháp ựịnh lượng β-agonists (clenbuterol, salbutamol) trong thịt lợn bằng kỹ thuật LC/MS/MS.
Bao gồm các thắ nghiệm thiết kế như sau:
Thắ nghiệm 3.1. Xác ựịnh tắnh ựặc hiệu/chọn lọc:
mẫu thử. Nếu là mẫu trắng thì phải không ựược cho tắn hiệu phân tắch.
Bước 2. Sau khi chuẩn bị mẫu (mẫu trắng hoặc mẫu thực), thêm chuẩn ở hàm lượng gần LOQ, lặp lại tối thiểu 6 lần. So sánh kết quả mẫu trắng thêm chuẩn với mẫu trắng, so sánh sắc ựồ của hai nhóm mẫu ựể ựánh giá tắnh ựặc hiệu/chọn lọc (phải cho tắn hiệu chất cần phân tắch) và sắc ký khối phổ phải ựạt số ựiểm IP ≥ 4.
Thắ nghiệm 3.2. Xác ựịnh giới hạn phát hiện (LoD) và giới hạn ựịnh lượng (LoQ)
Thêm dung dịch chuẩn salbutamol, clenbuterol vào mẫu thịt (mẫu trắng) sao cho hàm lượng các chất có trong mẫu khá nhỏ. Xử lý mẫu và thực hiện phân tắch trên thiết bị LC-MS/MS theo các ựiều kiện ựã chọn. Tìm nồng ựộ chuẩn trong nền mẫu tối thiểu của clenbuterol và salbutamol (Cmin Clen và Cmin Sal) sao cho sau khi tách chiết, làm sạch, tiêm vào máy với thể tắch 10 ộL dung dịch, mũi sắc ựồ khối có tỷ số (T) của tắn hiệu (S) so với nhiễu ựường nền (N) ựáp ứng ựược ựiều kiện:
S
3 ≤ T = ---- ≤ 15 Trong ựó S là tắn hiêu; N là nhiễu ựường nền
N
Khi ựó giới hạn phát hiện (LoD) ựược tắnh theo công thức: Cmin
LoD = 3 x --- <15 Trong ựó Cmin lànồng ựộ cho mũi sắc ựồ
T có tỷ số T
Giới hạn ựịnh lượng (LoQ) ựược tắnh theo công thức: LoQ = 3 x LoD
Thắ nghiệm 3.3. Xác ựịnh giới hạn quyết ựịnh (CCα) và khả năng phát hiện (CCβ)
Thắ nghiệm xác ựịnh CCα: Chuẩn bị 20 mẫu trắng ở nồng ựộ nhỏ nhất mà PTN có thể phát hiện và khẳng ựịnh; tắnh trung bình, tắnh ựộ lệch chuẩn (phải khác 0) và tắnh CCα theo công thức: CCα = trung bình + 2,33 SD.
đánh giá: trong số 20 mẫu trắng ở nồng ựộ nhỏ nhất mà PTN có thể phát hiện và khẳng ựịnh, không có quá 01 mẫu có nồng ựộ vượt CCα.
Thắ nghiệm xác ựịnh CCβ: Chuẩn bị 20 mẫu trắng thêm chuẩn ở nồng ựộ CCα, tắnh trung bình, tắnh ựộ lệch chuẩn và tắnh CCβ theo công thức: CCβ = CCα + 1,64 SD.
đánh giá: trong số 20 mẫu trắng ở nồng ựộ nhỏ nhất mà PTN có thể phát hiện và khẳng ựịnh, không có quá 01 mẫu có nồng ựộ vượt CCβ.
Thắ nghiệm 3.4. Xác ựịnh khoảng tuyến tắnh của ựường chuẩn
Chuẩn bị mẫu thịt âm tắnh thêm chuẩn β-agonists (clenbuterol, salbutamol) có nồng ựộ 0; 0,2; 0,6; 1,8; 5,4; 16,2 ộg/kg và nội chuẩn là 1ppb. Chuẩn bị mẫu và phân tắch mẫu theo quy trình phân tắch. Cuối cùng bơm dịch chiết lên hệ thống máy LC/MSMS và phần mềm của thiết bị sẽ tự lập phương trình tuyến tắnh y = ax + b. Tiêu chắ chấp nhận: hệ số hồi quy 0,99 ≤ R2 ≤1.
Thắ nghiệm 3.5. Xác ựịnh ựộ thu hồi (R%), ựộ chụm (CV%) và ựộ chụm trung gian (CVp) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chuẩn bị mẫu thịt âm tắnh thêm chuẩn β-agonists (clenbuterol, salbutamol) có nồng ựộ 0,4; 0,6; 0,8 ộg/kg và nội chuẩn là 1ppb: Cân 5,0g ổ 0.1g mẫu thịt ựã ựược xay nhỏ, ựồng nhất cho vào ống ly tâm. Thêm 20,0; 30,0; 40,0 ộl ở nồng ựộ 100 ppb dung dịch chuẩn clenbuterol, salbutamol; 50 ộl dung dịch chuẩn nội β- agonists (salbutamol-d3, clenbuterol- d9) 100ppb; ựể yên 15 phút. Sau ựó tiến hành chiết và làm sạch mẫu theo quy trình phân tắch. Cuối cùng bơm dịch chiết lên hệ thống máy LC/MSMS và tắnh toán kết quả.
đánh giá kết quả thắ nghiệm theo quy ựịnh trongquyết ựịnh 657/2002/EC (Decision 657/EC, 2002):
- độ thu hồi ựạt yêu cầu khi giá trị tắnh nằm trong khoảng 40 -120% (Hàm lượng chất ≤ 1 ppb);
- độ chụm và ựộ chụm trung gian ựạt yêu cầu khi giá trị tắnh nằm trong khoảng ≤ 30% (Hàm lượng chất ≤ 1 ppb).
Thắ nghiệm 3.6. đảm bảo chất lượng kết quả phép thử
Bố trắ thắ nghiệm như sau: Từng lô thắ nghiệm, bố trắ 01 mẫu trắng, 01 mẫu dương tắnh ựã biết nồng ựộ nhưng người phân tắch/chuẩn bị mẫu không ựược biết tình trạng β-agonists (clenbuterol, salbutamol) có trong mẫu. Cụ thể như sau:
* Mẫu 1: Chuẩn bị mẫu thịt âm tắnh thêm nội chuẩn β-agonists (salbutamol- d3, clenbuterol- d9) có nồng ựộ 1ppb: Cân 5,0g ổ0.1g mẫu thịt ựã ựược nghiền nhuyễn cho vào ống ly tâm. Thêm 50 ộl dung dịch chuẩn nội β-agonists (salbutamol-d3, clenbuterol- d9) 100ppb, ựể yên 15 phút.
*Mẫu 02: Chuẩn bị mẫu thịt dương tắnh (thắ nghiệm lô 2) và ựã kiểm tra phân tắch ựể biết nồng ựộ, thêm chuẩn nội salbutamol-d3, clenbuterol- d9 ựể có nồng ựộ 1ppb: Cân 5,0g ổ0.1g mẫu thịt ựã ựược nghiền nhuyễn cho vào ống ly tâm. Thêm 50 ộl dung dịch chuẩn nội β-agonists (salbutamol-d3, clenbuterol- d9) 100 ppb ựể yên 15 phút. Tiến hành chiết, làm sạch mẫu theo quy trình phân tắch và bơm lên máy ựể phân tắch.
đánh giá: Mẫu trắng phải cho kết quả âm tắnh; mẫu dương tắnh phải cho kết quả dương và với ựộ thu hồi ựạt yêu cầu theo quyết ựịnh 657/2002/EC.
2.3.4. Ứng dụng phương pháp ựã chuẩn hóa ựể phân tắch mẫu thực tế:
Bước 1. Phân tắch ựịnh tắnh bằng kỹ thuật ELISA với loại kắt ựã ựược chuẩn hóa.
Bước 2. Phân tắch ựịnh lượng bằng kỹ thuật LCMSMS với loại quy trình ựã ựược chuẩn hóa.
2.3.4.1. Phương pháp lấy mẫu:
Mẫu ựược thu thập tại các cơ sở kinh doanh thịt lợn giai ựoạn 2012 - 2013 tại các tỉnh Phú Thọ, Hải Phòng, Nam định, Hà Nam, Thái Bình, Quảng Ninh. Mẫu thịt ựược thu thập một cách ngẫu nhiên tại các cửa hàng kinh doanh thịt lợn. Việc thu thập thông tin ựể xác ựịnh các nhân tố rủi ro tiềm tàng kết hợp với tỷ lệ tồn dư β-agonists (salbutamol, clenbuterol) trong thịt lợn ựược thực hiện bằng các phiếu ựiều tra thiết kế sẵn (phụ lục 2). Phiếu ựiều tra bao gồm các thông tin về nguồn gốc của thịt, nơi giết mổ, khối lượng thịt ựược bán hàng ngày và các dữ liệu liên quan tới người thực hành bán thịt lợn về tuổi tác, giới tắnh, số năm kinh nghiệm kinh doanh, có tham gia lớp tập huấn về an toàn thực phẩm trong kinh doanh không? Việc thu thập thông tin cũng ựược tiến hành ựồng thời cùng với cửa hàng khi thu thập mẫu.
với trọng lượng 250 - 300 gam. Sau khi lấy mẫu, mẫu ựược ựựng vào túi nilong, dán nhãn, ựựng trong hộp xốp, bảo quản ở nhiệt ựộ không quá 40C và ựược vận chuyển về phòng thắ nghiệm. Nếu mẫu không ựược phân tắch ngay, phải bảo quản mẫu ở nhiệt ựộ ≤ -180C. Số lượng mẫu như bảng 2.2 sau: