1.3.1 Trên thế giới:
Tình hình nghiên cứu chung: Trước những năm 50 của thế kỷ XX, việc luu giữ tinh trùng ở điều kiện nhiệt độ thấp như bảo quản trong tủ lạnh hoặc trong đá khô đã được thực hiện, tuy nhiên kể từ khi công trình của Blaxter được công bố vào năm 1953 trên đối tượng cá trích (Clupea herengus), việc bảo quản tinh đã được tiến hành phổ biến trên nhiều đối tượng thủy sản. Cho đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu bảo quản tinh được thực hiện trên hơn 200 loài cá, trong đó có trên 30 loài cá biển [110] với việc sử dụng các dung dịch muối làm chất bảo quản [70] và một số chất làm chất chống đông như DMSO (Dimethyl sulfoxide), Ethylene glycol, Methanol, Glycerol, Trehalose. Tóm lại, ở các đối tượng khác nhau sẽ có các quy trình bảo quản tinh khác nhau. Và có rất nhiều công trình nghiên cứu bảo quản tinh trùng đã được nghiên cứu thành công và công bố rộng rãi như cá trích [30]; cá hồi [26, 27, 33]; cá chạch [69], cá mú đen [56]; cá trê châu Âu [77]; cá chình Nhật [90]; cá chép [64, 66, 80, 115, 117]; cá đù vàng [75], …
Đối với cá nước ngọt: Năm 1986, Chao và ctv [41]công bố kết quả bảo quản tinh 6 loài cá rô phi bao gồm Oreochromis aureus, O. mossambicus, O. niloticuscá rô lai giữa O. niloticus và O. mosambicus, và Oreochromis spp. pH của tinh dịch các loài cá rô phi dao động từ 6,2-8,2. Dung dịch bảo quản bao gồm 15% sữa và sử dụng chất chống đông là Methanol ở nồng độ 5%. Tinh trùng được pha loãng với tỉ lệ 1:1 và được nhanh chóng làm lạnh xuống -35oC và hạ nhiệt độ với tốc độ 5oC/ phút cho tới -70oC rồi chuyển vào giữ trong nitơ lỏng. Tỉ lệ thụ tinh của tinh trùng rã đông đạt được sau 22 ngày bảo quản (tinh rã đông) khá tương đồng với lô đối chứng (tinh tươi) (72,7%, và 85,7%); với con lai đạt được tỉ lệ thụ tinh là 93,4%, đối chứng là 90,0%. Riêng cá rô phi đỏ (Oreochromis spp.) sau 304 ngày bảo quản, tinh vẫn có khả năng thụ tinh.
Năm 1978, Stein và Bayrle [108] tiến hành bảo quản tinh trùng các loài cá hồi nước ngọt theo phương pháp của Nagase. Dung dịch bảo quản bao gồm 10% DMSO và hai
chất bảo quản khác nhau; chất bảo quản 1 có các thành phần như sau: 750 mg NaCl, 200 mg NaHCO3, 53 mg Na2HPO4, 23 mg MgSO4.7H2O, 38 mg KCl, 46 mg CaCl2, 100 mg glucose, 500 mg glycine, 100 ml nước cất và 200 ml lòng đỏ trứng gà; chất bảo quản 2 gồm có: 750 mg NaCl, 200 mg NaHCO3, 38 mg KCl, 100 mg glucose, 100 ml nước cất và 200 ml lòng đỏ trứng gà. Tinh trùng được pha loãng ở tỉ lệ 1:3 (tinh dịch: chất bảo quản), tinh pha loãng được cho trực tiếp vào nitơ lỏng. Sau 7 ngày bảo quản, tiến hành rã đông tinh trùng trong 10 ml dung dịch NaHCO3 1%. Hoạt lực tinh trùng đạt 70% với thời gian hoạt động của tinh trùng chỉ trong 30 giây.
Theo Horváth và Urbanyi (2000) [62], tinh trùng cá trê (Clarias gariepinus) đã được bảo quản thành công trong nitơ lỏng. Tinh được thu bằng cách giết cá đực, dung dịch bảo quản gồm 6% đường fructose và 10% DMSO, pH được điều chỉnh bằng dung dịch đệm NaHCO3 0,1N. Tinh sau khi pha loãng với dung dịch theo tỉ lệ 1:1, được cân bằng ở nhiệt độ 3oC trong 10 phút. Sau đó chuyển tinh vào cọng rạ thể tích 0,25 ml và làm lạnh theo chương trình chạy nhiệt áp dụng theo Magyary và ctv[81].Phương pháp rã đông nhanh (trong thời gian 5 giây) ở nhiệt độ trong tủ ấm 40oC. Kết quả thụ tinh là 90,0- 95,0% so với đối chứng hoạt lực tinh trùng sau khi rã đông là 50,0%.
Kết quả về bảo quản tinh trùng cá chép trong nitơ lỏng đã được Horváth và ctv công bố năm 2007. Sử dụng 5 chất bảo quản khác nhau gồm: sucrose, glucose, fructose, KCl và dung dịch muối đẳng trương và 2 chất chống đông được sử dụng: DMSO và Methanol với nồng độ 10%. Kết quả đạt được cao nhất khi sử dụng glucose và fructose kết hợp với 10% Methanol là dung dịch bảo quản (tỉ lệ thụ tinh lần lượt là: 74,0±15,0% và 71,0±12,0%) [62]
Năm 2009, Yasui và ctv [124] đã công bố kết quả về ảnh hưởng của phương pháp rã đông lên hoạt lực của tinh trùng cá trắm cỏ Ctenophayryngodon idella sau khi bảo quản trong nitơ lỏng bằng các cách rã đông khác nhau, kết quả là rã đông các cọng rạ ở nhiệt độ 35◦C trong 30 giây cho phần trăm hoạt lực cao nhất 83,4±2,1%.
Tinh trùng của một số loài thuộc họ cá tầm như cá tầm Sterlet (Acipenser ruthenus), cá tầm Beluga (Huso huso) hay cá tầm (Scaphirhynchus albus) đã được nghiên cứu bảo quản trong nitơ lỏng bằng cách pha loãng tinh trùng ở tỉ lệ 1:1, trong đó dung dịch bảo quản gồm
chất bảo quản mT (modified Tsvetkova’s) với thành phần (23,4 mM sucrose; 0,25 mM KCl;
30 mM Tris và pH được điều chỉnh đạt đến 8) và chất chống đông được sử dụng là Methanol 5% và 10%. Tỉ lệ thụ tinh và tỉ lệ nở của tinh trùng sau khi rã đông là cao nhất khi sử dụng 5%
Methanol (39±11% và 32±12%) [65].
Đối với các loài cá nước mặn lợ: Năm 1953, Blaxter là người đầu tiên nghiên cứu bảo quản thành công tinh trùng cá trích (Lupea herenffus) với thời gian bảo quản là sáu tháng ở nhiệt độ - 70oC trong dung dịch nước biển với nồng độ 0,34% và chất chống đông Glycerol 12,5%, tinh trùng được pha loãng ở tỉ lệ 1:4. Kết quả thu được là 80- 85,0% trứng thụ tinh với tinh trùng được bảo quản sau khi rã đông và cho thụ tinh.
Cho đến nay vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng ở các đối tượng cá biển, có khoảng 30 loài đã và đang được nghiên cứu[110], nhiều nhất là ở cá song (Epinephlus taurina). Theo nghiên cứu của Withler và ctv [121] ở tinh trùng cá song, hai chất bảo quản được sử dụng có thành phần (chất bảo quản 1 gồm 7,65 mg NaCl, 4,5 mg NaHCO3, 251 mg buffer hòa trong 1000 ml nước cất, chất bảo quản 2 bao gồm 6,57 mg NaCl, 4,5 mg NaHCO3, 251 mg buffer hòa trong 1000 ml nước cất). Chất chống đông là DMSO 10%. Sau khi cân bằng ở 5-10oC tinh được chuyển vào trong các cọng rạ có thể tích 1 ml và lạm lạnh trong hơi nitơ lỏng. Nhiệt độ rã đông ở 21-26oC trong tủ ấm. Kết quả thu được là khoảng 50-75% tinh trùng có hoạt lực sau khi rã đông.
Artificial seminal plasma (ASP) và 10% ethylene glycol (EG) là chất bảo quản và chất chống đông tối ưu cho bảo quản tinh trùng cá đù vàng trong nitơ lỏng. Với quy trình làm lạnh được thực hiện bằng cách hạ nhiệt độ từ nhiệt độ ban đầu xuống -76oC sau đó
cho vào nitơ lỏng ở -196oC, tinh trùng được pha loãng ở tỉ lệ 1:3 và được bảo quản trong cọng rạ 0,25ml. Sau đó, các cọng rạ được rã đông ở nước ấm (37oC). Kết quả thu được là tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ nở sau 1 tuần và 1 năm rã đông lần lượt là 45,7±3,2%, 27,2±5,0%
và 37,5±4,4% 27,2±5,0% [75].
Cùng trên một đối tượng, nhưng ở trong từng điều kiện cụ thể sẽ có một quy trình bảo quản lạnh khác nhau. Ví dụ như cùng trên một đối tượng là cá hồi, Stein và Bayrle [108] đã bảo quản tinh trùng các loài cá hồi nước ngọt theo phương pháp của Nagase.
Sau 7 ngày bảo quản, tinh được rã đông nhanh trong 10 ml dung dịch NaHCO3 1%. Hơn
70,0% tinh trùng hoạt động sau khi rã đông, thời gian hoạt động của tinh trùng 30 giây.
Trong khi đó, Cabrita và ctv [33] đã tiến hành nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá hồi vân trong cọng rạ có thể tích lớn 0,5 ml, 1,8 ml và 5 ml. Tỷ lệ pha loãng tinh dịch là 1:3 trong dung dịch theo Erdahl và Graham với 7% DMSO, 10% lòng đỏ trứng và 7,5 mg/ml promine. Kết quả là tỷ lệ thụ tinh ở cọng rạ 0,5 ml là 84,0%, cọng rạ 1,8 ml là 73,2%, cọng rạ 5 ml là 73,0%.
1.3.2 Ở Việt Nam:
Quy trình bảo quản tinh trùng cũng đã được nghiên cứu ở Việt Nam, song chủ yếu là trên các đối tượng là gia súc. Tuy nhiên chủ yếu là bảo quản tinh trùng trong thời gian ngắn, tinh dịch được lưu giữ ở nhiệt độ thấp khả năng thụ tinh có thể duy trì trong thời gian 1 đến 2 tuần [14]. Các nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá mới được thực hiện từ những năm 2000, nhưng phần lớn cũng chỉ bảo quản trong thời gian ngắn, khoảng một vài ngày.
Một số loài cá nước ngọt như cá chép, trắm cỏ, Mrigan, cá bỗng đã được nghiên cứu bảo quản tinh thành công, kết quả đạt được: tỷ lệ thụ tinh của tinh trùng cá chép đạt đến 81,7%, tỷ lệ nở cá con là 75,0%; cá Trắm cỏ có tỉ lệ từ 47,3% đến 97,4%, tỷ lệ nở cá con là 77,0%; cá bỗng tỷ lệ thụ tinh từ 34,7% đến 51,7%, tỷ lệ nở cá con là 74,0% [2].
Năm 2003, Nguyễn Minh Thành và ctv [11] đã công bố kết quả đề tài nghiên cứu bảo quản tinh cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) trong nitơ lỏng. Nghiên cứu sử dụng hai chất bảo quản là Hanks và Hanks không canxi, chất chống đông là DMSO 10%, tỷ lệ pha loãng là 1:6 và 1:9. Tinh dịch pha loãng được làm đông trong máy đông tinh Ncool LM10, sau đó nhúng thẳng vào nitơ lỏng. Các cọng rạ chứa tinh đông được rã đông sau thời gian bảo quản từ 7 ngày đến 3 tháng trong nitơ lỏng. Các cọng rạ được nhúng trong nước ấm 40◦C trong 10 giây để rã đông được kiểm tra hoạt lực và thụ tinh với trứng ngay sau khi rã đông. Tỷ lệ thụ tinh trung bình là 30,3% đối với dung dịch Hanks và 44,5% đối với dung dịch Hanks không canxi.