Một số nghiên cứu cho rằng mật độ tinh trùng có quan hệ mật thiết với thời gian bảo quản. Mật độ tinh trùng thấp có thời gian bảo quản ngắn hơn so với tinh dịch có mật độ tinh trùng cao hơn ở cùng điều kiện bảo quản. Để bảo quản tinh trùng được thời gian dài thì khi chọn mẫu tinh bảo quản ta nên chọn tinh có chất lượng tốt, mật độ tinh trùng cao. Chất lượng tinh phụ thuộc vào độ tuổi và mùa vụ sinh sản của cá [17].
Mật độ tinh trùng được xác định bằng buồng đếm hồng cầu Haematocymetes (MARIENFIELD, Germany) trên kính hiển vi có độ phóng đại 400X. Tinh dịch được pha loãng trong tube với tỷ lệ pha loãng là 1:1000 (hút 1μl tinh dịch cho vào 1000μl 0,9% NaCl), lắc đều sau đó hút tinh dịch đã pha lỗng cho một ít lên buồng đếm hồng cầu đã chuẩn bị sẵn. Đếm tinh trùng trong các ô đếm hồng cầu (đếm tổng số tinh trùng trong 4 ô đếm ở 4 góc và 1 ơ ở giữa). Mật độ tinh trùng được xác định theo công thức:
M = A x 4000 x R x 1000 80
Trong đó: M: Mật độ tinh trùng trong 1 ml tinh dịch (TB/ml) A: Tổng số tinh trùng trong 80 ơ đếm
R: Độ pha lỗng 1000: Hệ số pha lỗng 80: Tởng số ô đếm
4000: Số nghịch đảo thể tích dung dịch của 1 ơ
2.4.2.4 Hoạt lực của tinh trùng
Tinh trùng được pha loãng trong nước cất với tỷ lệ 1:100 (hút 1μl tinh dịch cho vào 99 μl nước cất), sau đó hút 1 μl tinh đã được pha loãng cho lên lamel và quan sát sự vận động của tinh trùng dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 400X.Những mẫu có tinh trùng hoạt lực trên 90% được đưa vào nghiên cứu.
Bảng 2.1 Một số đặc điểm lý học của tinh dịch cá chẽm mõm nhọn [8]
Thông số Nhỏ nhất Lớn nhất Trung bình
Thể tích tinh dịch (ml/cá
đực) 1,10 1,50 1,28±0,15
Mật độ tinh trùng (x 109
TB/ml) 28,70 34,40 31,35±2,12
Hoạt lực tinh trùng (%) 94,00 98,00 95,80±1,23
Thông qua bảng 2.1, tinh trùng đưa vào nghiên cứu có chất lượng tương đối cao và phù hợp cho nghiên cứu.
2.4.3 Phương pháp bớ trí thí nghiệm
Nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá chẽm mõm nhọn trong nitơ lỏng được trình bày ở Hình 2.1
Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá chẽm mõm nhọn trong nitơ lỏng. Thí nghiệm tỷ lệ pha lỗng:
Tinh dịch được pha loãng ở các tỷ lệ pha loãng khác nhau 1:1, 1:3, 1:5 và 1:10 trong chất bảo quản ASP (tinh dịch: ASP). Tinh dịch pha loãng được hút vào các cọng rạ có thể tích 0,25 ml và bảo quản trong nitơ lỏng. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 4 lần.
Tinh dịch cá chẽm mõm nhọn Tỷ lệ pha loãng tối ưu cho bảo quản lạnh
Chất bảo quản
Pha loãng Chất chống đơng Quy trình bảo quản
4chất bảo quản khác nhau 1:1, 1:3, 1:5, 1:10 4 chất chống đơng khác nhau 3 quy trình bảo quản khác nhau
Thí nghiệm xác định chất bảo quản:
Tiến hành pha loãng tinh dịchtrong 4 chất bảo quản (RSW, RFW, M-Her, ASP) ở tỷ lệ 1:3 (tinh dịch: chất bảo quản).Tinh dịch pha lỗng được hút vào các cọng rạ có thể tích 0,25 ml và bảo quản trong nitơ lỏng. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 4 lần.
Thí nghiệm xác định chất chống đông:
Tinh dịch được pha loãng ở tỷ lệ 1:3, sử dụng ASP là chất bảo quản cùng với 4 chất chống đông khác nhau (DMSO, methanol, glycerol, ethylene glycol) ở 4 nồng độ 5%, 10%, 15% và 20% trong các cọng ra 0,25ml. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 4 lần.
Thí nghiệm xác định quy trình bảo quản:
Tinh dịch pha lỗng được làm lạnh bằng các quy trình bảo quản khác nhau. Thứ nhất, nhúng trực tiếp các cọng rạ chứa mẫu vào nitơ lỏng. Quy trình thứ hai là sử dụng phương pháp hạ nhiệt độ từ từ 10oC/phút từ 25oC xuống - 40oC sau đó hạ xuống -180oC và cuối cùng cho xuống nitơ lỏng để bảo quản. Quy trình làm lạnh thứ ba là quy trình làm lạnh gồm 2 bước: tiến hành hạ nhiệt độ cọng rạ xuống -76oC rồi cho xuống nitơ lỏng. Quy trình 4: tiến hành đặt các cọng rạ ở các độ cao 2, 4 và 6 cm trên bề mặt nitơ lỏng. Ở mỗi độ cao, các cọng rạ được đặt trên các giá trong thời gian làm lạnh trên hơi nitơ lỏng trong vòng 5 phút trước khi nhúng vào nitơ lỏng. Sau khi bảo quản, tiến hành rã đông mẫu để đánh giá hoạt lực của tinh trùng sau 1 tuần, 1 tháng và 1 năm.
Thành phần của các chất bảo quản được sử dụng trong thí nghiệm được thể hiện ở Bảng 2.2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 2.2 Thành phần 4 chất bảo quản trong 100 ml nước cất Thành phần Chất bảo quản RSW RFW M-Her ASP NaCl (g) 0,75 0,675 0,6 0,5 NaH2PO4(g) - - - 0,02 NaHCO3 (g) 0,02 0,0015 0,004 0,01 KCl (g) 0,02 0,03 0,025 0,04 CaCl2.2H2O (g) 0,0265 0,0175 0,02 0,01 MgCl2.6H2O (g) - 0,001 0,035 0,02 pH 7,8 7,5 7,7 8,1
Áp suất thẩm thấu
(mOsm/kg) 342 335 327 320
RSW: Ringer’s solution for seawater fish species; RFW: Ringer’s solution for freshwater fish species; M-Her: Modified of Her; ASP: artificial seminal plasma.
Phương pháp rã đông:
Dùng panh kẹp lấy cọng rạ từ bình nitơ ra và nhúng vào nước ấm ở 37oC trong vòng 30 giây, sau đó dùng kéo cắt 2 đầu cọng rạ cho tinh dịch vào eppendof và tiến hành kiểm tra hoạt lực và vận tốc của tinh trùng sau bảo quản.
* Thí nghiệm thụ tinh:
Thí nghiệm nhằm xác định tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ nở của tinh trùng sau khi rã đông và tinh tươi được tiến hành với tỷ lệ tinh trùng/trứng là 500/1. Cho 500 trứng vào 1 cái đĩa có đường kính 15 cm sau đó lấy 8, 40, 80 µl tinh dịch rã đơng (0,6x109 tế bào/ml) hoặc 2, 10, 20 µl tinh tươi (2,5x109 tế bào/ml) cho vào đĩa đã có trứng. Trứng thụ tinh được ấp trong nước biển với độ măn 32‰ ở 19oC và những trứng hư được loại bỏ. Khi trứng phát triển thành phôi ở giai đoạn phôi vị,tỷ lệ thụ tinh được xác định bằng tỷ lệ giữa số trứng phát triển đến giai đoạn phôi vị và tổng số trứng. Tỷ lệ nở được thể hiện bằng phần trăm cá bột nở ra so với tổng số trứng thụ tinh trong thời gian bảo quản khác nhau (1 tuần, 1 tháng và 1 năm)
2.5 Phương pháp xử lý sớ liệu
Số liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn. Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel. Ảnh hưởng của chất bảo quản, tỷ lệ pha loãng, chất chống đơng và quy trình bảo quản lạnh tinh trùng được phân tích phương sai một yếu tố (One-way ANOVA) bằng so sánh Ducan với mức ý nghĩa P<0,05thông qua phần mềm SPSS version 16.0.