Chất bảo quản:

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.2 Đặc điểm tinh trùng cá

1.2.5.4 Chất bảo quản:

Chất bảo quản là một dung dịch muối, có tác dụng làm tăng dung tích và duy trì trạng thái vơ hoạt cũng như thời gian sống tiềm sinh của tinh trùng. Việc nghiên cứu tìm ra chất bảo quản thích hợp khơng những có thể đạt được mục đích pha lỗng tăng dung tích của tinh dịch mà cịn có thể nâng cao tỉ lệ thụ tinh của tinh dịch, kéo dài thời gian sống cũng như tiết kiệm được nhiều tinh dịch. Lựa chọn chất bảo quản cần chú ý các điều kiện sau:

- Có chất dinh dưỡng cần cho việc trao đởi chất của tinh trùng. - Tránh được sự kích thích của nhiệt độ.

- Áp lực thẩm thấu phải bằng áp suất thẩm thấu của tinh dich hoặc nguyên sinh chất trong tinh trùng.

- Có pH thích hợp với pH tinh dịch.

- Giúp tinh trùng sống nhưng không vận động.

Chất bảo quản khác nhau theo loài, và quan trọng nhất là phải giữ được tinh trùng ở trạng thái bất động. Chất bảo quản có thể được pha chế trước và giữ trong tủ lạnh trước khi sử dụng. Tỷ lệ pha lỗng tối ưu cần được xác định theo từng lồi [118].

Công thức của chất bảo quản không nhất thiết phải phức tạp. Một vài dung dịch đơn giản như dung dịch chứa NaCl, NaHCO3 và Leceithin [84] cũng cho hiệu quả tốt. Ở một số lồi cá biển như cá trích Clupea harengus và cá đối Mugil cephalus [30]; các tác giả

đã sử dụng thành công nước biển pha lỗng cho thêm chất chống đơng. Những nghiên cứu gần đây trên cá rô phi cho thấy sử dụng nước pha thêm 5% Methanol và 15% sữa bột để pha loãng sẹ cũng có kết quả [84].

Gần đây một số tác giả đã sử dụng đường để làm chất bảo quản cho một số loài cá nước ngọt. Horváth và ctv [63] đã sử dụng chất bảo quản với thành phần là 350mM glucose, 30mM Tris, pH 8,0 và 10% Methanol cho cá chép. Yavas và Bozkurt [125] sử dụng 350mM glucose, 30mM Tris, và 5% Glycerol (pH = 8,0) cho cá trắm cỏ và kết quả tỷ lệ thụ tinh của tinh trùng sau bảo quản là 85,6±2,8%, hoạt lực tinh trùng sau bảo quản là 83,4±2,1%. Tóm lại, việc lựa chọn và sử dụng chất bảo quản là một khâu quan trọng góp phần vào sự thành cơng của kỹ thuật bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng.

Bảng 1.1 Các chất bảo quản dùng cho bảo quản lạnh tinh trùng một vài loài cá

Loài Loại chất bảo quản Tài liệu tham khảo

Cá bơn Dung dịch Stein [37]

Cá bơn chấm Dung dịch Turbot [114]

Cá đù vàng Dịch tương nhân tạo [75]

Cá chình Nhật Bản Dung dịch Suquet [113]

Cá rô biển MPRS [43]

Cá tuyết Đại Tây Dương,

cá tuyết chấm đen Sửa đổi của Mounib [100]

Cá tráp, cá mú 150mM NaCl [57, 58]

1.2.5.5 Chất chống đông và nồng độ chất chống đông:

Chất chống đông (chất bảo vệ tế bào) là những hợp chất nhỏ có khả năng xâm nhập vào các tế bào tinh trùng. Chất chống đông được thêm vào chất bảo quản để hạn chế tối đa ảnh hưởng của sốc nhiệt, giúp tinh trùng sống lâu trong q trình làm lạnh và rã đơng. Một số nghiên cứu cho thấy, ở nhiệt độ thấp, khi trong dung dịch bảo quản khơng có chất chống đơng, chất nguyên sinh của tinh trùng có hiện tượng bị kết lại và tế bào bị phá hủy, dẫn đến tinh trùng bị chết. Hiện nay, các chất chống đông thường được sử dụng nhất là DMSO, Glycerol và Methanol. Một việc quan trọng nữa là nồng độ chất chống đông. Nồng độ chất chống đơng phải thích hợp thì mới bảo vệ được các tế bào tốt nhất trong quá trình làm lạnh và rã đơng. Nồng độ các chất chống đơng của các lồi cá khác nhau thì

khác nhau, và nồng độ tốt nhất cho các loài cá thường từ 10-15% bao gồm cả DMSO, Glycerol và Methanol.

Bảng 1.2 Các loại chất chống đông dùng trong nghiên cứu bảo quản lạnh tinh trùng [39]

Acetamide Aline (L) Albumin Ammonium acetate Chloroform Choline Dexatrans Diethyle glycol Dimethyl acetamide Dimethyl formamide Dimethyl sulfoxide Erythritol Ethanol Ethylene glycol Formamide Glucose Glycerol Glycerophosphate Glycerol monoacetate Glycerin Hydroxyethyl starch Inositol Lactose Magnesium chloride Magnesium sulfate Maltose Mannitol Mannose Methanol Methyl acetamide Methyl formamide Methyl urea Phenol Pluronic polyols Polyethylene glycol Polyvinyl pyrrolidone Proline Propylene gycol Pyridine-N-Oxide Ribose Serine Sodium bromide Sodium chloride Sodium iodide Sodium nitrate Sodium sulfate Sorbitol Sucrose Triethylene glycol Trimethylamine acetate Urea Valine Xylose

Trong nghiên cứu bảo quản tinh cá rô phi vằn O. niloticus của Rana và McAndrew [98] cho thấy DMSO có độc tố nặng hơn Methanol khi so sánh các mức nồng độ giống nhau. Có lồi có phở DMSO khá rộng như cá đù đỏ (Sciaenop ocellatusa) 7-15%, nhưng cá hồi (Salmonid sp) chỉ cho kết quả tốt khi sử dụng Methanol 10%. Tóm lại, việc lựa chọn chất chống đông và nồng độ các chất chống đông là một trong những yếu tố góp phần vào thành công của bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng.

Bảng 1.3 Các loại chất chống đông dùng cho bảo quản lạnh tinh trùng của một vài loài cá

Loại chất chống đông Kết hợp với Loài cá Tài liệu tham khảo

Glucose 5% Ringer Cá măng [40]

Mật ong 0,5% Ringer Cá mùi đen [40]

Sữa Ringer-methanol Cá rô phi [38]

Lòng đỏ trứng 10% DMSO Cá rơ vàng [45]

Lịng đỏ trứng 20% + sucrose 0,5% - Cá hồi vân [71]

Lòng đỏ trứng 15% DMSO Cá trê [88]

Lòng đỏ trứng 10% + sucrose 0,6M Erdahl-DMSO Cá chó [25]

1.2.5.6 Thời gian cân bằng:

Thời gian cần thiết để chất chống đông thẩm thấu vào tinh trùng gọi là thời gian cân bằng [120]. Trong hầu hết các trƣờng hợp, thời gian cân bằng có thể kéo dài từ 10 đến 30 phút nhưng có thể thay đổi phụ thuộc vào chất chống đông được sử dụng. Nếu nồng độ chất chống đơng cần thiết gây độc cho tế bào thì thời gian cân bằng để chất chống đông thẩm thấu vào tế bào cần được rút ngắn. Một số tài liệu cho rằng, thời gian cân bằng là không cần thiết. Rana và McAndrew [98] đã kết luận thời gian cân bằng ảnh hưởng không có ý nghĩa tới hoạt lực tinh trùng cá rô phi (O. niloticus) sau khi rã đơng, vì trước khi làm lạnh thời gian từ khi pha loãng đến khi đóng cọng đã mất khoảng 30 phút.

1.2.5.7 Tốc độ hạ nhiệt:

Một trong những yếu tố quan trọng trong kỹ thuật bảo quản lạnh là tốc độ hạ nhiệt. Tốc độ hạ nhiệt phải đủ chậm để cho nước ra khỏi các tế bào để các tinh thể băng khơng hình thành trong các tế bào và nhanh chóng gia tăng nồng độ muối trong các tế bào để không làm hỏng các thành phần trong tế bào [82, 83]. Tốc độ hạ nhiệt ảnh hưởng lớn đến thành cơng của việc bảo quản tinh, vì vậy cần tìm được chu trình hạ nhiệt phù hợp cho từng đối tượng nghiên cứu. Có nhiều phương pháp làm lạnh hỗn hợp tinh dịch trước khi chuyển vào lưu giữ trong nitơ lỏng. Có thể làm lạnh trong nitơ lỏng cách bề mặt của nó khoảng 3-10 cm, hoặc làm lạnh trong đá. Thuận lợi hơn cả là làm lạnh bằng chương trình hạ nhiệt được cài sẵn trong máy tính. Tốc độ làm lạnh được điều chỉnh với các tốc độ

khác nhau tùy theo lồi. Trong thực tế, phương pháp làm lạnh thành cơng và thực tế nhất về bảo quản lạnh tinh trùng cá là phương pháp làm lạnh hai bước. Bước đầu tiên là giảm nhiệt độ của tinh trùng từ nhiệt độ lưu giữ (ví dụ, nhiệt độ lưu giữ bình thường tinh trùng cá hồi là 4oC) đến khoảng -70oC. Tốc độ làm lạnh tối ưu cho tinh trùng từng loài khác nhau ở bước này là khác nhau. Bước thứ hai là cho tinh dịch vào nitơ lỏng -196oC [44].

Theo Forgason và ctv [51] phương pháp làm lạnh trong hơi nitơ lỏng ở mức cao vào khoảng 5-10cm trong khoảng thời gian từ 10-12 phút sau đó chuyển từ từ xuống nitơ lỏng, phương pháp này không cần thời gian cân bằng. Moczarski [85] cũng làm lạnh tinh cá chép Nhật bản trên bề mặt và cách nitơ lỏng 3-5cm. Phương pháp của Bouysson và Chupin [13] đã thử nghiệm trên các mức nhiệt độ khác nhau trong nitơ lỏng như: nhiệt độ cách bề mặt nitơ lỏng 2mm là -80oC xuống -85oC, 4mm là -70oC xuống -75oC, và 20mm là -50oC xuống -55oC. Dung dịch tinh cá hồi có chứa 7-10% DMSO làm lạnh với tốc độ hạ nhiệt 30-35oC/phút bằng chương tình đã cài đặt sẵn trong máy tính, kết quả từ 0-98% trứng được thụ tinh. Tốc độ hạ nhiệt ảnh hưởng rất lớn đến kết quả bảo quản vì vậy cần tìm ra quy trình hạ nhiệt phù hợp cho từng đối tượng nghiên cứu.

1.2.5.8 Phương pháp rã đông:

Sau quá trình bảo quản, tinh cá cần phải được rã đông để đưa vào sử dụng. Do điều kiện bảo quản ở nhiệt độ thấp, tinh trùng đang ở trạng thái kết tinh nên cần áp dụng phương pháp rã đông chính xác mới đảm bảo tinh trùng sống lại sau khi rã đơng. Tùy vào các lồi cá khác nhau, tùy vào việc sử các chất chống đông và tùy vào điều kiện thí nghiệm mà tiến hành rã đơng ở các thang nhiệt độ và thời gian rã đông khác nhau. Ví dụ Horvath và Urbanyri [62] rã đông tinh trùng cá trê ở 40oC trong 5 giây, tỷ lệ vận động của tinh trùng đạt 50%. Yasui và ctv [124] rã đông tinh trùng cá chạch Misgurnus

anguillicaudatus ở nhiệt độ 25oC trong 10 giây cho kết quả thụ tinh là 47%. Theo nghiên

cứu của Le và ctv [75]đã tiến hành rã đông tinh trùng cá đù vàng Larimichthys polyactis ở nhiệt độ 37oC trong 30 giây, tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ nở sau 1 tuần lần lượt là 45,7±3,2% và 27,2±5,0%.

Dựa vào những đặc điểm và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt lực của tinh trùng, cho đến nay đã cónhiều nghiên cứu ứng dụng rộng rãi biện pháp bảo quản tinh trùng ở dạng

nguyên tinh dịch trong các dụng cụ khô ráo ở nhiệt độ thấp đã có thể kéo dài tuổi thọ của tinh trùng một cách hiệu quả. Đặc biệt là phương pháp bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng đang được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trên thế giới.

1.3 Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng:

1.3.1 Trên thế giới:

Tình hình nghiên cứu chung: Trước những năm 50 của thế kỷ XX, việc luu giữ tinh trùng ở điều kiện nhiệt độ thấp như bảo quản trong tủ lạnh hoặc trong đá khô đã được thực hiện, tuy nhiên kể từ khi cơng trình của Blaxter được cơng bố vào năm 1953 trên đối tượng cá trích (Clupea herengus), việc bảo quản tinh đã được tiến hành phổ biến trên nhiều đối tượng thủy sản. Cho đến nay đã có nhiều cơng trình nghiên cứu bảo quản tinh được thực hiện trên hơn 200 loài cá, trong đó có trên 30 loài cá biển [110] với việc sử dụng các dung dịch muối làm chất bảo quản [70] và một số chất làm chất chống đông như DMSO (Dimethyl sulfoxide), Ethylene glycol, Methanol, Glycerol, Trehalose. Tóm lại, ở các đối tượng khác nhau sẽ có các quy trình bảo quản tinh khác nhau. Và có rất nhiều cơng trình nghiên cứu bảo quản tinh trùng đã được nghiên cứu thành công và công bố rộng rãi như cá trích [30]; cá hồi [26, 27, 33]; cá chạch [69], cá mú đen [56]; cá trê châu Âu [77]; cá chình Nhật [90]; cá chép [64, 66, 80, 115, 117]; cá đù vàng [75], …

Đối với cá nước ngọt: Năm 1986, Chao và ctv [41]công bố kết quả bảo quản tinh 6

lồi cá rơ phi bao gồm Oreochromis aureus, O. mossambicus, O. niloticuscá rô lai giữa O. niloticus và O. mosambicus, và Oreochromis spp. pH của tinh dịch các lồi cá rơ phi

dao động từ 6,2-8,2. Dung dịch bảo quản bao gồm 15% sữa và sử dụng chất chống đông là Methanol ở nồng độ 5%. Tinh trùng được pha lỗng với tỉ lệ 1:1 và được nhanh chóng làm lạnh xuống -35oC và hạ nhiệt độ với tốc độ 5oC/ phút cho tới -70oC rồi chuyển vào giữ trong nitơ lỏng. Tỉ lệ thụ tinh của tinh trùng rã đông đạt được sau 22 ngày bảo quản (tinh rã đông) khá tương đồng với lô đối chứng (tinh tươi) (72,7%, và 85,7%); với con lai đạt được tỉ lệ thụ tinh là 93,4%, đối chứng là 90,0%. Riêng cá rô phi đỏ (Oreochromis spp.) sau 304 ngày bảo quản, tinh vẫn có khả năng thụ tinh.

Năm 1978, Stein và Bayrle [108] tiến hành bảo quản tinh trùng các loài cá hồi nước ngọt theo phương pháp của Nagase. Dung dịch bảo quản bao gồm 10% DMSO và hai

chất bảo quản khác nhau; chất bảo quản 1 có các thành phần như sau: 750 mg NaCl, 200 mg NaHCO3, 53 mg Na2HPO4, 23 mg MgSO4.7H2O, 38 mg KCl, 46 mg CaCl2, 100 mg glucose, 500 mg glycine, 100 ml nước cất và 200 ml lòng đỏ trứng gà; chất bảo quản 2 gồm có: 750 mg NaCl, 200 mg NaHCO3, 38 mg KCl, 100 mg glucose, 100 ml nước cất và 200 ml lịng đỏ trứng gà. Tinh trùng được pha lỗng ở tỉ lệ 1:3 (tinh dịch: chất bảo quản), tinh pha loãng được cho trực tiếp vào nitơ lỏng. Sau 7 ngày bảo quản, tiến hành rã đông tinh trùng trong 10 ml dung dịch NaHCO3 1%. Hoạt lực tinh trùng đạt 70% với thời gian hoạt động của tinh trùng chỉ trong 30 giây.

Theo Horváth và Urbanyi (2000) [62], tinh trùng cá trê (Clarias gariepinus) đã được bảo quản thành công trong nitơ lỏng. Tinh được thu bằng cách giết cá đực, dung dịch bảo quản gồm 6% đường fructose và 10% DMSO, pH được điều chỉnh bằng dung dịch đệm NaHCO3 0,1N. Tinh sau khi pha loãng với dung dịch theo tỉ lệ 1:1, được cân bằng ở nhiệt độ 3oC trong 10 phút. Sau đó chuyển tinh vào cọng rạ thể tích 0,25 ml và làm lạnh theo chương trình chạy nhiệt áp dụng theo Magyary và ctv[81].Phương pháp rã đông nhanh (trong thời gian 5 giây) ở nhiệt độ trong tủ ấm 40oC. Kết quả thụ tinh là 90,0- 95,0% so với đối chứng hoạt lực tinh trùng sau khi rã đông là 50,0%.

Kết quả về bảo quản tinh trùng cá chép trong nitơ lỏng đã được Horváth và ctv công bố năm 2007. Sử dụng 5 chất bảo quản khác nhau gồm: sucrose, glucose, fructose, KCl và dung dịch muối đẳng trương và 2 chất chống đông được sử dụng: DMSO và Methanol với nồng độ 10%. Kết quả đạt được cao nhất khi sử dụng glucose và fructose kết hợp với 10% Methanol là dung dịch bảo quản (tỉ lệ thụ tinh lần lượt là: 74,0±15,0% và 71,0±12,0%) [62]

Năm 2009, Yasui và ctv [124] đã công bố kết quả về ảnh hưởng của phương pháp rã đông lên hoạt lực của tinh trùng cá trắm cỏ Ctenophayryngodon idella sau khi bảo quản

trong nitơ lỏng bằng các cách rã đông khác nhau, kết quả là rã đông các cọng rạ ở nhiệt độ 35◦C trong 30 giây cho phần trăm hoạt lực cao nhất 83,4±2,1%.

Tinh trùng của một số loài thuộc họ cá tầm như cá tầm Sterlet (Acipenser ruthenus), cá tầm Beluga (Huso huso) hay cá tầm (Scaphirhynchus albus) đã được nghiên cứu bảo quản trong nitơ lỏng bằng cách pha loãng tinh trùng ở tỉ lệ 1:1, trong đó dung dịch bảo quản gồm

chất bảo quản mT (modified Tsvetkova’s) với thành phần (23,4 mM sucrose; 0,25 mM KCl; 30 mM Tris và pH được điều chỉnh đạt đến 8) và chất chống đông được sử dụng là Methanol 5% và 10%. Tỉ lệ thụ tinh và tỉ lệ nở của tinh trùng sau khi rã đông là cao nhất khi sử dụng 5% Methanol (39±11% và 32±12%) [65].

Đối với các loài cá nước mặn lợ: Năm 1953, Blaxter là người đầu tiên nghiên cứu

bảo quản thành cơng tinh trùng cá trích (Lupea herenffus) với thời gian bảo quản là sáu tháng ở nhiệt độ - 70oC trong dung dịch nước biển với nồng độ 0,34% và chất chống đông Glycerol 12,5%, tinh trùng được pha loãng ở tỉ lệ 1:4. Kết quả thu được là 80- 85,0% trứng thụ tinh với tinh trùng được bảo quản sau khi rã đông và cho thụ tinh.

Cho đến nay vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng ở các đối tượng cá biển, có khoảng 30 lồi đã và đang được nghiên cứu[110], nhiều nhất là ở cá song (Epinephlus taurina). Theo nghiên cứu của Withler và ctv [121] ở tinh trùng cá song, hai chất bảo quản được sử dụng có thành phần (chất bảo quản 1 gồm 7,65 mg NaCl, 4,5 mg NaHCO3, 251 mg buffer hòa trong 1000 ml nước cất, chất bảo quản 2 bao gồm 6,57 mg NaCl, 4,5 mg NaHCO3, 251 mg buffer hịa trong 1000 ml nước cất). Chất chống đơng là DMSO 10%. Sau khi cân bằng ở 5-10oC tinh được chuyển vào trong các cọng rạ có thể tích 1 ml và lạm lạnh trong hơi nitơ lỏng. Nhiệt độ rã đông ở 21-26oC trong tủ ấm. Kết quả thu được là khoảng 50-75% tinh trùng có hoạt lực sau khi rã đông.