1.1. Cơ sở khoa học
1.1.5. Các nhân tố ảnh hưởng tới sức sống của tinh trùng khi đông lạnh hoặc giải đông
Khi đông lạnh hoặc giải đông, các hiện tượng nêu trên sẽ đe doạ sự sống của tinh trùng, nhưng khi có biện pháp chống đông thì khả năng tồn tại
của tinh trùng là thực tế. Các nhân tố sau đây giúp tinh trùng tồn tại khi đông lạnh hoặc giải đông (Ditto, 1992) [49].
1.1.5.1. Sức đề kháng của tinh trùng đối với đông lạnh
Khả năng của tinh trùng chịu đựng được đông lạnh gọi là sức kháng đông và thường được đo bằng tỷ lệ hồi phục lại của tinh trùng sau khi đông lạnh và giải đông. Ở bò đực, sức kháng đông của tinh trùng là khác nhau, tùy theo từng cá thể bò đực, điều kiện lúc lấy tinh và tuổi của bò đực. Cụ thể như sau:
a. Giống, cá thể và tuổi
Sự khác nhau về sức kháng đông của tinh trùng thể hiện rõ giữa các cá thể bò đực, nhưng không rõ ràng giữa các giống mặc dù chúng ta có thể thấy sự khác nhau này. Giống có một yếu tố cận huyết cao thì có thể, thể hiện sức kháng đông của tinh trùng thấp. Tuổi của bò đực giống cũng ảnh hưởng tới sức kháng đông. Bò đực có tuổi 1-1,5 năm tuổi, tinh trùng có sức kháng đông thấp, từ 2 năm tuổi trở lên có sức kháng đông cao. Nhưng từ 6 năm tuổi trở lên tinh trùng của chúng có sức kháng đông giảm xuống.
b. Mùa vụ
Vào mùa hè nhiệt độ không khí cao nên sức kháng đông của tinh trùng vào mùa này thường thấp. Hiện tượng giảm này còn tùy thuộc vào từng cá thể và tuổi của chúng, bò đực nào già hơn thì dễ bị tác động của nhiệt hơn. Tỷ lệ thụ tinh của tinh trùng trong mùa hè nóng bức có thể thấp hơn so với tinh trong mùa mát mẻ (Ditto, 1992) [49].
c. Lấy tinh nhiều lần
Khi lấy tinh liên tiếp thì tinh trùng thu được từ lượt phóng tinh thứ hai cho thấy sức kháng đông tốt hơn so với tinh trùng thu được từ lượt phóng tinh đầu. Tinh trùng thu được từ lượt phóng tinh thứ ba và thứ tư sẽ duy trì được sức kháng đông tốt, nhưng tinh trùng thu được từ lần phóng tinh thứ năm trở đi có sức kháng đông thấp hơn.
1.1.5.2. Thành phần của môi trường pha loãng loãng
Thành phần cơ bản của môi trường pha loãng tinh dịch là đường saccharid, chất đệm và lòng đỏ trứng gà. Sức sống của tinh trùng khi đông lạnh và giải đông khác nhau tùy theo các thành phần này.
Nồng độ tối ưu của lòng đỏ trứng là 15-20 %, nếu nồng độ này quá thấp hoặc quá cao thì không tốt cho tinh trùng, mặc dù lòng đỏ trứng đã bảo vệ tinh trùng không bị tổn hại trong khi đông lạnh. Chức năng này chủ yếu do tác động của lipoprotein và lecithin trong lòng đỏ. Đường saccharide đóng vai trò quan trọng trong môi trường, do tác động đến áp suất thẩm thấu, nó có tác dụng bảo vệ tinh trùng khi ở nhiệt độ thấp và là nguồn năng lượng cho tinh trùng.
Những saccharide có khối lượng phân tử cao, làm cho hoạt lực của tinh trùng tốt hơn sau khi đông lạnh và giải đông. Các saccharide có phân tử lượng cao (tính theo phân tử lượng giảm dần) bao gồm: Trisaccharide, disaccharide, hexoses và pentone. Trong số hexose thì glucose có hiệu quả nhất, còn các chất đa đường polysaccharide thì ít có tác dụng. Bảo vệ lạnh bằng saccharide là nhờ có nhiều nhóm hydroxy (-OH) trong cấu trúc, do đó có xu hướng hình thành liên kết hydro.
Chất đệm có vai trò quan trọng trong duy trì màng sinh chất của tinh trùng khi đông lạnh và khi giải đông, trong kích thích trao đổi chất diễn ra bình thường ở tinh trùng sau giải đông đồng thời duy trì sức sống của chúng. Chất đệm phải phù hợp như là môi trường khi đông lạnh và phải có đặc tính sau:
- Duy trì mức thấp nhất về sự tổn hại cho tinh trùng do các muối gây ra - Phải tan trong nước với hằng số phân ly điện tích là 6-8.
1.1.5.3. Bảo quản ở 50C trước khi đông lạnh
Bảo quản ở 50C trước khi đông lạnh sẽ tăng cường sức kháng đông cho tinh trùng bò đực. Thông thường tinh bò đực sau khi khai thác và đủ tiêu chuẩn pha chế thì tiến hành xử lý gồm:
- Pha loãng lần đầu tinh dịch ở 350C
- Làm lạnh dần xuống 50C và bảo quản trong thời gian 1,5-2 giờ (cách 1) - Pha loãng lần hai với môi trường có chứa glycerol
- Cân bằng trong 2-3 giờ - Đông lạnh tinh trùng
- Bảo quản tinh trùng đã làm lạnh ở 50C trước khi pha loãng lần hai đã nâng cao đáng kể tỷ lệ sống của tinh trùng sau khi đông lạnh và giải đông.
Một cách khác (cách 2) của phương pháp này là bảo quản qua đêm (20- 22 giờ), tinh trùng đã làm lạnh ở 50C, trước khi pha loãng lần hai. Sức sống của tinh trùng theo cách xử lý hai tốt hơn so với cách sử lý thông thường (cách 1). Cách thứ ba là bảo quản tinh trùng qua đêm khi đã cân bằng với glycerol trong 20-22 giờ, ở 50C sau khi pha loãng lần hai. Cách hai tốt hơn nhiều so với cánh thứ ba và điều này thể hiện sức kháng đông của tinh trùng có khác nhau tùy theo giai đoạn nhạy cảm với nhiệt độ thấp (Tsuyoshi, 1992) [73].
1.1.5.4. Nồng độ của glycerol
Nồng độ glycerol trong môi trường pha loãng cuối cùng để làm đông lạnh tinh trùng bò vào khoảng 7 %, nhưng tỷ lệ này có hơi khác nhau tùy theo các thành phần của môi trường pha loãng. Nồng độ tối ưu cho sức sống của tinh trùng là 11 % với sữa khử bơ. Nồng độ glycerol trong môi trường pha loãng có mối tương quan đáng tin cậy với tốc độ giải đông, đó là nồng độ glycerol cao trong môi trường pha loãng là cần thiết cho tốc độ giải đông nhanh (Hiroshi, 1992) [53].
Thời gian từ lúc bổ sung glyceryl vào môi trường pha loãng (pha loãng lần hai) đến khi bắt đầu làm đông lạnh được gọi là thời gian cân bằng glycerol.
1.1.5.5. Tốc độ làm lạnh
Hình 1.9. Ảnh hưởng của glycerol trong dung dịch NaCl so với nồng độ
NaCl trong dung dịch còn lại khi dung dịch NaCl (0,15M) được đông lạnh (Hiroshi, 1992) [53]
Tốc độ làm lạnh quá cao sẽ gây tổn hại tới tinh trùng vì nó gây ra siêu lạnh, thể vẩn và nước lưu giữ trong tế bào. Điều đó gây ra đông lạnh ngoại bào và sau đó đông lạnh nội bào. Tốc độ làm lạnh chậm sẽ gây ra tập trung nồng độ cho cả dung dịch ngoại bào và dung dịch nội bào và sẽ làm rối loạn tế bào, đây được coi là ảnh hưởng của dung dịch. Tốc độ làm lạnh tối ưu là tốc độ làm giảm tối đa cả đông lạnh nội bào và ảnh hưởng của dung dịch.
Tốc độ làm lạnh tối ưu này khác nhau không chỉ theo loại tế bào mà còn theo các yếu tố như các thành phần của thể vẩn tế bào và loại chất chống đông băng. Chẳng hạn dung dịch đường saccharide được đông lạnh nhanh (đông lạnh 2-4 phút, 50C xuống -790C), cho hoạt lực tinh trùng sau giải đông cao hơn so với đông lạnh chậm (đông lạnh 45 phút, từ 50C xuống -790C), vì đã ngăn cản được ảnh hưởng của dung dịch. Môi trường pha loãng có nồng độ glycerol 5-7 % được đông lạnh nhanh (đông lạnh 3-5 phút, từ 50C xuống 1300C) cho hoạt lực tinh trùng cao hơn so với đông lạnh chậm (đông lạnh 20- 40 phút, từ 50C xuống -790C) (Hiroshi, 1992) [53].
1.1.5.6. Tốc độ giải đông
Tốc độ giải đông tinh đông lạnh có ảnh hưởng lớn đến sức sống, hoạt lực, tỷ lệ acrosome bình thường và quá trình trao đổi chất bình thường của tinh trùng. Giải đông tinh cọng rạ bằng nước 350C sức sống tinh trùng cao hơn so với nước 4 200C. Giải đông ở nước 35-750C cũng cho tỷ lệ acrosome bình thường cao hơn so với nước 4 hoặc 200C. Nhưng nếu giải đông bằng nước có nhiệt độ cao hơn nữa, chẳng hạn nước 900C, sẽ không làm tăng sức sống của tinh trùng. Nếu tinh được bảo quản ở nhiệt độ 370C sau khi giải đông, cọng rạ nào được giải đông nhanh ở nhiệt độ cao hơn thì sẽ duy trì được sức sống tinh trùng cao hơn.
1.1.5.7. Thời gian bảo quản
Tinh trùng đông lạnh phải luôn luôn được bảo quản ngập chìm trong nitơ lỏng (-1960C), nếu bảo quản tốt sau vài chục năm, tỷ lệ sống và hoạt lực tinh trùng của tinh trùng vẫn không thay đổi, khả năng thụ tinh vẫn không bị giảm (Hà Văn Chiêu, 1997) [10]. Ở Thụy Sỹ tinh đông lạnh bảo quản 20 năm vẫn thụ tinh và bò mẹ đẻ bê con ngày 25-7-1975 (America Breeders Service, 1991) [38]. Ở Nhật Bản tinh cọng rạ bảo quản 4-13 năm vẫn có hoạt lực tinh trùng 45-55 % và có tỷ lệ thụ tinh 54 %. Có nhiều trường hợp tinh đông lạnh bảo quản 20 năm vẫn có tỷ lệ thụ tinh là 69,8 % (Hiroshi, 1992) [53].