1.3. Đặc điểm sinh học và bệnh học của E. coli
1.3.3. Các phương pháp phát hiện E. coli trong thực phẩm và nước uống
- Phương pháp nuôi cấy truyền thống để phát hiện E. coli gồm ba bước: tăng sinh chọn lọc trên môi trường phù hợp như BGBL (Brilliant Green Bile Lactose 2%) hoặc
canh Lauryl Sulphate Tryptose đối với thực phẩm và môi trường TTC lactose với natri heptadecylsunphat đối với nước, phân lập trên một trong các môi trường như Endo Agar, EMB (Eosine Methylene Blue Agar), DA (Desoxycholate agar) và thử sinh hóa trên các môi trường MRVP (Methyl Red Proskauer) và Simons citrate agar.
+ Tăng sinh chọn lọc: mục tiêu của bước này là làm tăng số lượng E. coli có trong mẫu, ức chế một số lượng lớn các sinh vật khác. Môi trường dùng để tăng sinh chọn lọc đối với thực phẩm là BGBL vì trong thành phần của môi trường này có mật bò chọn lọc vi khuẩn Gram âm, ức chế sự phát triển của vi khuẩn Gram dương và môi trường tăng sinh chọn lọc đối với nước là môi trường TTC lactose với natri heptadecylsunphat.
+ Phân lập: bước này nhằm tách biệt và nhận dạng E. coli từ tập hợp các quần thể vi sinh vật khác nhau trong mẫu sau bước tăng sinh chọn lọc. Có nhiều môi trường khác nhau được sử dụng để phân lập E. coli, mỗi môi trường nhận dạng một vài đặc tính chung nhất của E. coli. Mức độ chọn lọc, tính đặc trưng và hình thái biểu hiện của khuẩn lạc E. coli trên từng môi trường cũng khác nhau. Vì vậy các tiêu chuẩn an toàn vệ sinh khuyến khích cùng một lúc sử dụng ít nhất hai loại môi trương phân lập khác nhau để tăng cường khả năng phát hiện E. coli, trong đó môi trường EMB được khuyến khích sử dụng.
+ Thử phản ứng sinh hóa: chọn những khuẩn lạc nghi ngờ là E. coli từ môi trường phân lập để thử nghiệm IMViC.
Mẫu kiểm tra được kết luận là có E. coli khi làm đổi màu và sinh hơi trên môi trường tăng sinh, tạo khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập và cho kết quả sinh hóa là: I(+), MR(+), VP(-), Ci(-) [14,29].
- Các phương pháp cải tiến: do phương pháp truyền thống tốn nhiều thời gian, chậm thu kết quả, mất nhiều công sức, tốn kém … nên nhiều phương pháp nhanh và tự động đã được phát triển và thương mại hóa, một số phương pháp không truyền thống đang được phát triển và sử dụng là:
+ Phương pháp ELISA (Enzyme – Linked Immunosorbent Assay)
Phương pháp ELISA (hấp thụ miễn dịch dùng enzyme) được quan tâm nhiều do đơn giản và hiệu quả cao. Phương pháp này được dựa trên nguyên tắc là sử dụng
kháng thể phủ bên ngoài những đĩa giếng (microplate). Kháng nguyên (nếu có) trong mẫu sẽ được giữ lại trên bề mặt giếng. Các kháng nguyên này sẽ được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể thứ cấp có gắn với enzyme horseradish hoặc alkaline phosphatase. Khi bổ sung một cơ chất đặc hiệu vào giếng, enzyme sẽ xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra sản phẩm có màu hoặc phát sáng. Theo dõi sự đổi màu có thể phát hiện và định lượng kháng nguyên trong mẫu. Phương pháp này có độ tin nhạy và độ đặc hiệu cao. ELISA được sử dụng rộng rãi dưới dạng các bộ hóa chất (kit) thương mại (phát hiện Salmonella, E. coli gây bệnh, Listeria …) và có thể được cải tiến để tự động hóa. ELISA có thể sử dụng phát hiện và định lượng vi sinh vật trong thực phẩm trong thời gian vài giờ sau khi tăng sinh . Kỹ thuật này có độ nhạy phát hiện khoảng 106 CFU/ml. Tuy nhiên phương pháp này vẫn cần thực hiện bước tăng sinh và tăng sinh chọn lọc trước khi thực hiện các phản ứng miễn dịch [12,28].
+ Phương pháp lai phân tử
Phương pháp lai phân tử để phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm được dựa trên sự phát hiện một đoạn gene đặc trưng của vi sinh vật. Cơ sở của phương pháp này là sự bắt cặp của hai sợi nucleic acid mạch đơn (ADN, ARN) nếu có hai trình tự bổ sung ngược chiều nhau ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ tách mạch Tm của hai phân tử nucleic acid mạch đơn. Một trong hai hai mạch ADN bổ sung (thường là ADN mục tiêu) được cố định trên một giá thể rắn hoặc nằm ngay trên tế bào hay mô. Sự lai phân tử còn có thể xảy ra giữa ADN và ARN. Hiện nay đã có một số bộ kit thương mại dựa trên kĩ thuật phân tích nucleic acid dùng phát hiện E. coli gây bệnh trong thực phẩm [12,29].
+ Phương pháp PCR: giúp phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm một cách nhanh chóng và tin cậy. Phương pháp PCR được hình thành dựa trên đặc tính của enzyme polymerase, phản ứng PCR cho phép nhân bản đoạn ADN nằm giữa hai mồi thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide. Phương pháp này cho kết quả nhanh, ít tốn kém về mặt nhân sự, có thể nhận diện được những vi sinh vật khó nuôi cấy, việc nuôi cấy tăng sinh là đơn giản hơn và có khi không cần thiết. Ngoài ra hóa chất cho phản ứng PCR sẵn có hơn và dễ tồn trữ hơn so với trường hợp huyết thanh học và không cần dụng cụ và môi trường chẩn đoán phức tạp [12,28].