CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phương pháp nghiên cứu
Các nội dung nghiên cứu được trình bày tóm tắt ở sơ đồ 2.1
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ trình tự các nội dung nghiên cứu Ứng dụng xác định đặc tính
điểm chỉ của các alkaloid và flavonoid có trong lá, tâm Sen
Xây dựng qui trình chiết xuất, phân lập và tinh chế các alkaloid, flavonoid trong lá và tâm Sen.
Xác định độ tinh khiết các alkaloid, flavonoid phân lập được (≥ 95%)
Xác định cấu trúc các chất alkaloid, flavonoid bằng phổ nghiệm (UV, IR, MS, NMR)
Thiết lập chất đối chiếu từ các alkaloid và flavonoid phân lập
Xây dựng qui trình định lượng alkaloid, flavonoid trong lá và tâm Sen bằng phương pháp LC và CE
Ứng dụng định lượng alkaloid, flavonoid trong nguyên liệu và
chế phẩm từ lá, tâm Sen
32
2.4.1. Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc các alkaloid, flavonoid có trong lá và tâm Sen
2.4.1.1. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học của lá, tâm Sen
Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật trong lá Sen được thực hiện theo quy trình phân tích của I. Ciuley được cải tiến bởi ĐHYD TP. HCM.
Định tính thành phần hóa học trong dịch chiết dược liệu dựa vào phản ứng tạo tủa, tạo màu đặc trưng của các nhóm hợp chất.
Định tính thành phần alkaloid, flavonoid trong dịch chiết bằng sắc ký lớp mỏng và hiện màu với thuốc thử Dragendorff, FeCl3 1% trong cồn.
2.4.1.2. Chiết cao chiết toàn phần alkaloid và flavonoid từ lá, tâm Sen Khảo sát dung môi chiết
Khảo sát dung môi chiết được thiết kế theo Bảng 2.4 cho cả lá và tâm Sen.
Bảng 2.4. Khảo sát dung môi chiết alkaloid, flavonoid từ lá, tâm Sen.
Bình nón
Làm ẩm 30 phút
Khối lượng tâm Sen, lá
Sen (g)
Dung môi
Thể tích (ml)
Thời gian ngâm (giờ)
1 không
10
Nước 100
24
2 không Cồn 45% 100
3 không Cồn 70% 100
4 không Cồn 90% 100
5 không Cồn 96 % 100
6 Acid tartric 1% Nước 100
7 Acid tartric 1% Cồn 45% 100
8 Acid tartric 1% Cồn 70% 100
9 Acid tartric 1% Cồn 90% 100
10 Acid tartric 1% Cồn 96 % 100
Bột lá, tâm Sen được chiết bằng phương pháp ngâm lạnh lần lượt với các dung môi trên, so sánh khối lượng cắn toàn phần và khối lượng tủa thu được khi
cho phản ứng với thuốc thử Valse Mayer và phản ứng Cyannidin. Từ đó, chọn được dung môi thích hợp dùng trong chiết xuất alkaloid và flavonoid [12].
33
Chiết cao chiết toàn phần alkaloid và flavonoid từ lá Sen
Qui trình chiết xuất cao chiết toàn phần alkaloid và flavonoid từ lá Sen được trình bày trong sơ đồ 2.2.
Sơ đồ 2.2. Chiết xuất cao toàn phần và các phân đoạn alkaloid, flavonoid từ lá Sen bằng chiết phân bố lỏng-lỏng.
TT. Bertrand 5%
+ Dung môi chiết thích hợp, ngâm lạnh, trung hòa dịch chiết đến pH=5.
+ Cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm
+ Thêm NH4OH (đđ) đến pH = 3-4,
+ Chiết CHCl3, thu hồi CHCl3 dưới áp suất giảm
+ Thêm NH4OH (đđ) đến pH 5-6,
+ Chiết CHCl3, thu hồi CHCl3 dưới áp suất giảm Chiết với EtOAc, thu hồi dung môi dưới áp suất giảm + Thêm H2SO4 2% đến pH =1-2,
+ Chiết loại tạp với PE,
+ Thu hồi dung môi dưới áp suất giảm 32 kg bột lá Sen
+ Thêm NH4OH (đđ) đến pH 8-9,
+ Chiết CHCl3, thu hồi CHCl3 dưới áp suất giảm Dịch chiết đậm đặc (25 lít)
Dịch chiết pH = 1-2
Dịch acid pH = 1-2
Dịch nước pH = 3-4
Dịch nước pH = 5-6
Dịch kiềm pH = 8-9
Cao alkaloid N (71,3 g) Tủa B (1290 g)
Tủa F (130,6 g)
Cao A1 (57,4 g)
Cao A2 (102,6 g)
Cao A3 (50,8 g)
34
Chiết cao chiết toàn phần alkaloid và flavonoid từ tâm Sen
Qui trình chiết suất cao chiết toàn phần alkaloid và flavonoid từ tâm Sen được trình bày trong Sơ đồ 2.3.
Sơ đồ 2.3. Chiết xuất cao toàn phần và các phân đoạn alkaloid, flavonoid từ tâm Sen bằng chiết phân bố lỏng-lỏng.
Chiết với n-BuOH Cô áp suất giảm
+ Trung hòa đến pH 9 bằng NH4Cl 10%, + Chiết với CHCl3, cô áp suất giảm + Thêm H2SO4 2% đến pH =1-2, chiết phân bố loại tạp với PE.
+ Dịch acid để lạnh qua đêm, có kết tủa thô, lọc kết tinh
+ Dung môi chiết thích hợp, ngâm lạnh, trung hòa dịch chiết đến pH=5.
+ Thu hồi dung môi dưới áp suất giảm.
Dịch chiết đậm đặc (30 lít)
NH4OH 25% đến pH = 10-11, chiết với CHCl3
Chiết với NaOH 2% x 3 lần
Phân đoạn n-Bu (33,6 g)
+ Thêm H2SO4 2%, điều chỉnh đến pH=5 với NH4OH 25%, + Chiết với CHCl3, cô áp suất giảm
Chiết với EtOAc, thu hồi dung môi dưới áp suất giảm
+ Điều chỉnh đến pH=8 với NH4OH 25%,
+ Chiết với CHCl3, thu hồi dung môi dưới áp suất giảm Cô áp suất giảm
40 kg bột tâm Sen
Dịch lọc acid pH = 1-2
Dịch lọc acid pH = 1-2
Dịch chiết CHCl3
Lớp CHCl3 Dịch NaOH
Phân đoạn NP Phân đoạn P (63,4 g)
Dịch chiết pH 5
Dịch chiết pH 8
Kết tủa thô EN-1 (17,6 g)
Cao EF (125,4 g)
Dịch kiềm
Phân đoạn NP5 (135,7 g)
Phân đoạn NP8 (112,5 g)
35
Phương pháp tạo tủa alkaloid lá Sen với TT. Bertrand thu cao N
Cho alkaloid trong tủa B kết tủa với thuốc thử chung của alkaloid là Bertrand.
Alkaloid được hoàn nguyên bằng cách kiềm hóa với NaOH 2 % và chiết với chloroform.
Sơ đồ 2.4. Chiết xuất cao N từ cắn B bằng phương pháp tạo tủa với TT. Bertrand 2.4.1.3. Phân lập các alkaloid và flavonoid từ lá và tâm Sen
Cao A1, A2, A3, cao N, tủa F của lá Sen và các phân đoạn NP5, NP8, P, n-Bu, cao EF của tâm Sen được sử dụng để phân lập hợp chất tinh khiết.
Sắc ký cột chân không
Mục đích: tách cao A2, tủa F từ lá Sen thành các phân đoạn đơn giản hơn.
Bảng 2.5. Điều kiện tiến hành VLC phân đoạn A2 và tủa F từ lá Sen
Tiến hành Cao A2 Tủa F
Kích thước cột: dài (cm) x
đường kính trong (cm) 60 x 6 30 x 9
Khối lượng mẫu (g) 22,6 25,6
Khối lượng silica gel
(40-63àm) sử dụng (g) 600 600
+ Hòa trong NaOH 2%
+ Chiết với CHCl3
Acid sulfuric 2%, lọc
TT. Bertrand 5%
490 g tủa B
Dịch chiết nước acid
Tủa với TT. Bertrand
+ Tủa được rửa với nước acid sulfuric 0,5%
+ Ly tâm 9600 vòng/phút x 20 phút, làm khô + Rửa tủa lần lượt với CHCl3, EtOAc
Tủa Bertrand sau xử lý
Cao N (21,3 g)
36
Dung môi hòa tan mẫu CHCl3 MeOH
Nhồi cột Nhồi ướt và ổn định cột bằng
CHCl3 Nhồi khô
Nạp mẫu Nạp mẫu lỏng Nạp mẫu khô
Thể tích hứng phân đoạn (ml) 250 250
Dung môi rửa giải ban đầu 100% CHCl3 100% CHCl3
Dung môi rửa giải tiếp theo CHCl3- EtOAc với bước tăng dung môi EtOAc từ 0,5-1%
CHCl3-EtOAc; EtOAc- MeOH với bước tăng dung môi EtOAc hay MeOH phù hợp
Kiểm tra alkaloid, flavonoid trong các phân đoạn
UV 365, 254 nm,
alkaloid: TT. Dragendorff, CHCl3- MeOH - NH4OH (96:4:0,5)
UV 365, 254 nm;
flavonoid: TT. FeCl3, EtOAc-MeOH-H2O-acid
formic (100:17:13:0,5) Gộp phân đoạn giống nhau Các phân đoạn có thành phần giống nhau trên SKLM được
gộp chung, thu hồi dung môi, thu kết tinh hay kết tủa nếu có.
Sắc ký cột cổ điển
Mục đích: phân lập alkaloid từ cao A3, cao N, phân đoạn NP5, NP8 và flavonoid từ cao EF.
Bảng 2.6. Điều kiện tiến hành sắc ký cột cổ điển các cao A3, cao N lá Sen
Tiến hành Cao A3 Cao N
Kích thước cột: dài x đường kính
trong (cm) 60 x 6 60 x 6
Khối lượng mẫu (g) 10,6 21,30
Khối lượng silica gel
(40–63 àm) (g) 500 500
Dung môi hòa tan mẫu CHCl3
Nhồi cột Nhồi ướt và ổn định cột bằng CHCl3
Nạp mẫu Nạp mẫu lỏng Nạp mẫu khô
Thể tích hứng phân đoạn (ml) 15
Dung môi rửa giải ban đầu 100% CHCl3
Dung môi rửa giải tiếp theo CHCl3-MeOH với bước tăng dung môi phân cực từ 0,5-1 % Kiểm tra alkaloid, flavonoid trong
các phân đoạn
UV 365, 254 nm, alkaloid: Dragendorff, CHCl3–MeOH-NH4OH (96:4:0,5)
Thu gom phân đoạn giống nhau Các phân đoạn có thành phần giống nhau trên SKLM được gộp chung, thu hồi dung môi, thu kết tinh hay kết tủa nếu có.
Bảng 2.7. Điều kiện tiến hành sắc ký cột cổ điển phân đoạn NP5, NP8, cao EF tâm Sen.
Tiến hành Phân đoạn NP5, NP8 Cao EF
Kích thước cột: dài x đường
kính trong (cm) 60 x 6 60 x 6
Khối lượng mẫu (g) 25,70 (NP5); 22,5 (NP8) 25,6
Khối lượng silica gel
(40-63àm) (g) 700 350
Dung môi hòa tan mẫu CHCl3 MeOH
Nhồi cột Nhồi ướt Nhồi khô
37
Nạp mẫu Nạp mẫu lỏng Nạp mẫu khô
Thể tích hứng phân đoạn (ml) 15
Dung môi rửa giải ban đầu 100% CHCl3
Dung môi rửa giải tiếp theo
NP5: hệ CHCl3-MeOH NP8: hệ aceton- MeOH với bước tăng dung môi MeOH từ 0,25-0,5 %.
CHCl3- EtOAc, MeOH, H2O với bước tăng dung môi nước thấp.
Kiểm tra alkaloid, flavonoid trong các phân đoạn
UV 365, 254 nm,
alkaloid: TT. Dragendorff, CHCl3-MeOH-NH4OH
(96:4:0,5)
UV 365, 254 nm,
flavonoid: TT. FeCl3, EtOAc-MeOH-H2O-acid formic
(100:17:13:0,5) Thu gom phân đoạn
giống nhau
Các phân đoạn có thành phần giống nhau trên SKLM được gộp chung, thu hồi dung môi, thu kết tinh hay kết tủa nếu có
Sắc ký cột trên Sephadex LH-20
Mục đích: Phân tích và phân lập các chất từ các phân đoạn sắc ký cột:
Thu phân đoạn alkaloid P1-P3 từ phân đoạn P và n-Bu1 và n-Bu3 tinh khiết hơn từ n-BuOH. Phân lập flavonoid từ phân đoạn F1, F6, F8 của tủa F; phân đoạn EF-1-2 từ cao EF.
Bảng 2.8. Điều kiện tiến hành sắc ký cột Sephadex LH-20 các phân đoạn F1, F6, F8; EF-1-2; phân đoạn P và n-Bu.
Phân
đoạn Dung môi hòa tan
mẫu
Cột Sephadex LH-20 MeOH (1,2 m x 3 cm)
Cột Sephadex LH-20 DCM-aceton
(85:15) (1,2 m x 3 cm)
Kiểm tra phân đoạn thu hứng
F1 MeOH x
UV 365, 254 nm; TT. FeCl31%/cồn
SKLM với hệ dung môi EtOAc-MeOH-H2O-acid formic
(100:17:13:0,5) F6 MeOH x
F8 MeOH x
EF-1 MeOH x EF-2 MeOH x
n-Bu MeOH x UV 365, 254 nm; TT. Dragendorff
SKLM với hệ dung môi EtOAc-MeOH-NH4OH (6:2:2).
P DCM-
aceton
(85:15) x
UV 365, 254 nm, TT. Dragendorff
SKLM với hệ dung môi CHCl3-MeOH-NH4OH (90:10:0,5)
Sắc ký lỏng bán điều chế
Mục đích: phân lập alkaloid từ phân đoạn A2-1,A2-2, A2-3, A2-6, A2-8, A2-11, A2-12 của cao A2, phân đoạn n-BuII và flavonoid từ EF-3 của cao EF tâm sen, phân đoạn F6-3 của tủa F lá sen.
38
Điều kiện sắc ký
- Cột sắc ký: Phenomenex Synergi Fusion (250 x 10 mm; 5 àm); Phenomenex Synergi RP-Max (250 x 10 mm; 5 àm); Phenomenex Synergi Fusion (250 x 4,6 mm; 5 àm); Phenomenex Synergi RP-Max (250 x 4,6 mm;
Alkaloid: TEA 0,05% trong nước (pH được điều chỉnh từ 7-10 bằng dung dịch acid acetic 50%): ACN với chế độ dung môi, đẳng dòng hay gradient.
Flavonoid: acid formic 0,1 % pha trong nước, ACN, MeOH được khảo sát với chế độ dung môi, đẳng dòng hay gradient.
- Thể tớch tiờm mẫu: 50 – 500 àL. Tốc độ dũng: 2 – 5 ml/phỳt.;
- Nhiệt độ cột: 20 - 40 oC.
- Bước sóng phát hiện: được lựa chọn dựa trên phổ UV-Vis của nhóm hợp chất cần phân tích.
- Mẫu được hòa tan trong methanol hoặc pha động ở nồng độ 1-3 mg/mL, hỗ trợ bằng siêu âm. Sau đó mẫu được lọc qua màng lọc milipore 0,45μm trước khi tiêm vào hệ thống sắc ký.
- Hứng các phân đoạn dựa vào các pic trên sắc ký đồ. Kiểm tra các phân đoạn alkaloid và flavonoid bằng SKLM (soi UV 254, 365 nm và thuốc thử Dragendorff hoặc FeCl3), HPLC-PDA phân tích. Các phân đoạn có thành phần giống nhau được gộp chung, cô thu hồi dung môi.
Sắc ký phân bố ly tâm nhanh (FCPC)
Mục đích: phân lập alkaloid có độ phân cực mạnh từ phân đoạn P-2.
Một số hệ dung môi hai pha không đồng tan được thăm dò sao cho sự phân bố của các alkaloid cần tách khác nhau rõ ràng trên hai pha.
Bảng 2.9. Các điều kiện dung môi hai pha không đồng tan dự kiến thăm dò cho FCPC phân đoạn P-2.
Hệ dung môi hai pha Pha động Pha tĩnh Đánh giá sự phân bố của alkaloid trên hai pha
EtOAc-CHCl3-MeOH-H2O (1:6:4:1)
Pha dưới Pha trên + SKLM với hệ dung môi CHCl3-MeOH-NH4OH (90:10:0,5)
+TT. Dragendorff + HPLC-PDA (dự kiến) CHCl3-MeOH-HCl 0,1 M (4:4:2) Pha dưới Pha trên
CHCl3- Aceton- MeOH- HCl 0,1 M (6:1:2:1)
Pha dưới Pha trên
39 n-hexan-EtOAc-MeOH: H2O
(3:5:3:5)
Pha trên Pha dưới Cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm;
5 àm)
Pha động: ACN-TEA 0,05%, rửa giải gradient
Mẫu tiêm: pha trên và pha dưới được cô đến cắn và hòa tan trong MeOH, lọc qua màng lọc 0,45àm CHCl3-ACN-TEA 0,2% (4:2:3) Pha dưới Pha trên
CHCl3- MeOH- TEA 0,2%
(4:2:3)
Pha dưới Pha trên CHCl3-MeOH- H2O- NH3
(4:2:2:0,5)
Pha dưới Pha trên
Tiến hành hứng các phân đoạn (thể tích 15 mL/phân đoạn) ứng với các hệ dung môi. Các phân đoạn có thành phần giống nhau trên SKLM được gộp chung, cô thu hồi dung môi, cân khối lượng kết tinh hay tủa thu được.
2.4.1.4. Xác định độ tinh khiết và cấu trúc chất phân lập Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Tiến hành sắc ký lớp mỏng hoạt chất phân lập được với 3 hệ dung môi khác nhau, có độ phân cực sao cho 3 sắc ký đồ cho 3 vết có Rf lần lượt nằm trong khoảng 0,3;
0,5 và 0,8. Nếu sắc ký đồ chỉ có một vết sắc ký dưới đèn 254, 365nm và với thuốc thử Dragendorff hay FeCl3/cồn và VS của chất phân lập được trên cả 3 hệ dung môi thì chất phân lập được xem là tinh khiết SKLM[5].
Phương pháp HPLC/PDA
- Hòa tan chất phân lập được bằng MeOH của Merck để được dung dịch có nồng độ khoảng 1000 ppm. Tiến hành sắc ký với điều kiện thích hợp.
- Kiểm tra độ tinh khiết của pic cũng như đánh giá % tinh khiết chất phân lập bằng cách áp dụng phương pháp qui về 100% diện tích pic[5].
Xác định cấu trúc chất phân lập
Nếu các chất có độ tinh khiết sắc ký trên 95% thì sẽ được tiến hành đo phổ UV-Vis, IR, MS và NMR (1H, 13C, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, NOESY) để xác định cấu trúc và so sánh với các dữ liệu phổ đã công bố (nếu có).
2.4.2. Thiết lập một số chất đối chiếu alkaloid, flavonoid phân lập từ lá và tâm Sen
Các alkaloid, flavonoid được lựa chọn để thiết lập chất đối chiếu phải là những chất đại diện, chiếm hàm lượng lớn trong cây, có tác dụng sinh học cũng như có qui trình phân lập ổn định, khối lượng phân lập được nhiều (> 500 mg) với độ tinh khiết sắc ký cao (> 95%) để thiết lập chất đối chiếu (CĐC). Các bước thực hiện dựa theo
40
hướng dẫn của các tài liệu do ASEAN ấn bản về quy trình thiết lập CĐC, cụ thể như sau:
2.4.2.1. Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng CĐC
- Dữ liệu chuẩn dùng để nhận dạng chất nhằm cung cấp thông tin cho thiết lập hồ sơ nhận dạng CĐC. Việc nhận dạng chất dựa vào:
So sánh phổ của chất phân tích với phổ chất chuẩn trong cùng điều kiện.
So sánh thông tin phổ, dữ liệu hóa lí, hằng số vật lí của chất với tài liệu khoa học hoặc thông tin đã công bố. Tập hợp các dữ liệu chuẩn đó có thể khẳng định được hợp chất là đúng đối tượng nghiên cứu.
- Các phương pháp được sử dụng để xây dựng bộ dữ liệu gồm có:
Đo điểm chảy
Đo phổ tử ngoại khả kiến (dung môi MeOH); đo phổ hồng ngoại (trong KBr); đo phổ khối lượng (MS).
Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D-NMR (1H, 13C, DEPT) và 2D-NMR (COSY, HMBC, HSQC).
2.4.2.2. Xây dựng qui trình xác định độ tinh khiết của nguyên liệu thiết lập chât đối chiếu
Phương pháp HPLC/PDA
Mỗi CĐC được xây dựng quy trình xác định độ tinh khiết sắc ký với các điều kiện phân tích tương ứng với từng mẫu.
Quy trình được khảo sát tính phù hợp của hệ thống và thẩm định theo đúng yêu cầu của quy trình phân tích định lượng bằng HPLC.
Áp dụng phương pháp HPLC và qui về 100% diện tích pic để xác định độ tinh khiết của CĐC.
Phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng và/hoặc nhiệt vi sai (TGA/DSC) Xác định độ tinh khiết và hàm ẩm. Gia nhiệt tốc độ 1 oC/ phút đến qua khỏi nhiệt
độ nóng chảy của mẫu khoảng 50 oC, lưu lượng dòng khí nitơ 50 ml/ phút.
Mỗi mẫu xác định 3 lần, lấy kết quả trung bình.
41
2.4.2.3. Xây dựng TCCS đánh giá nguyên liệu thiết lập chất đối chiếu
- Căn cứ vào tính chất lý - hóa của nguyên liệu thiết lập CĐC và các CTCL
thông thường của CĐC gốc để xây dựng các CTCL của CĐC cần thiết lập. Chất đối chiếu đạt yêu cầu như CĐC hóa học thứ cấp dùng cho
phép thử định lượng. Các chỉ tiêu chất lượng (CTCL) và phương pháp đánh giá được xây dựng dựa trên
Tham khảo DĐVN và các dược điển quốc tế để lựa chọn phương pháp phù hợp đánh giá các CTCL.
Khảo sát lựa chọn chương trình sắc kí thích hợp để định lượng và xác định tạp chất.
Thẩm định phương pháp phân tích theo các chỉ tiêu: theo hướng dẫn ICH
- Các CTCL đề xuất xây dưng bao gồm: tính chất, độ ẩm, định tính, độ tinh khiết và tạp chất liên quan.
Yêu cầu kỹ thuật
Tính chất: Mô tả dạng định hình, mùi vị, độ tan của CĐC.
Độ ẩm: Được xác định theo phụ lục 9.6 DĐVN4 hoặc bằng phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng (TGA).
Định tính
Nhóm I: Phổ IR của CĐC phải có các dao động đặc trưng cho cấu trúc hóa học của CĐC đó và phù hợp với các dữ liệu đã công bố.
Nhóm II: Điểm chảy và năng suất quay cực của CĐC thực hiện theo hướng dẫn của phụ lục 6.7 và 6.4, DĐVN4 hoặc sử dụng phương pháp phân tích nhiệt vi sai.
Nhóm III: Dựa vào dữ liệu phổ học của CĐC phân lập được: UV, IR, MS, NMR.
Độ tinh khiết
Phương pháp HPLC/PDA: Xác định độ tinh khiết sắc ký bằng phương pháp HPLC- PDA (190-800nm), % độ tinh khiết của CĐC được tính bằng phương pháp qui về 100% diện tích pic. Diện tích của pic chính phải trên 95 % so với tổng diện tích các pic trên SKĐ. Bỏ qua pic của pha động và pic có S/N < 2/1.
Phương pháp phân tích nhiệt vi sai (DSC): xác định độ tinh khiết của hợp chất dựa vào biến thiên nhiệt độ trong mẫu.