Xác định đặc tính điểm chỉ dựa trên những thành phần hóa học có tác dụng sinh học chính (alakloid, flavonoid) cho nguyên liệu lá, tâm Sen của từng vùng, miền có ý nghĩa rất lớn trong việc định danh, bảo tồn giống và xác định chất lượng nguồn nguyên liệu đầu vào trong sản xuất, tồn trữ, lưu thông.
Xác định đặc tính điểm chỉ (dấu vân tay-DVT) bằng phương pháp SKLM, HPLC/PDA, CE-PDA/MS sẽ góp phần đề xuất các đặc tính có thể nhận biết lá và tâm Sen của từng vùng dựa trên việc đánh giá các giá trị Rf, tR, tM và tỉ lệ của những thông số này so với pic của thành phần hóa học đại diện cho cây, có hàm lượng cao và có tác dụng sinh học (nuciferin, quercetin 3-O-β-D-GlcA cho lá Sen; isoliensinin
và vitexin cho tâm Sen). Thêm vào đó, diện tích đỉnh các chất đại diện cho cây (là những pic lớn nhất) được qui về thang 10, sau đó lập tỉ số diện tích đỉnh các pic
còn lại so pic chính này, sẽ cũng cố thêm các đặc tính điểm chỉ nêu trên cho lá, tâm Sen mỗi vùng.
135
KẾT LUẬN
Sau quá trình thực hiện, luận án đã hoàn thành các nội dung nghiên cứu và đạt được tất cả các mục tiêu đề ra ban đầu.
1. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc alkaloid, flavonoid
Luận án đã phân lập được 35 hợp chất (21 alkaloid và 18 flavonoid) từ lá và tâm Sen. Tuy nhiên, chỉ xác định cấu trúc hóa học của 28 hợp chất do có 05 alklaoid
(nuciferin, pronuciferin, armepavin, norarmepavin, isoliensinin) và 02 flavonoid (isorhamnetin, quercetin 3-O-β -D-GlcA) hiện diện trong cả hai bộ phận dùng này.
Trong số 28 cấu trúc này, bao gồm:
05 alkaloid khung aporphin (nuciferin, 2-O-nornuciferin, caaverin, asimilobin, apoglaziovin), 02 alkaloid khung proaporpphin (pronuciferin, pronuciferin N-oxid), 04 alkaloid khung benzylisoquinolin (armepavin, norarmepavin, N-methylcoclaurin, lotusin), 05 alkaloid khung bisbenzylisoquinolin (isoliensinin, liensinin, neferin, isoliensinin N2’-oxid, isoliensinin N2-oxid).
01 flavonoid dạng aglycon khung isoflavonoid (calycosin), 11 flavonoid khung euflavonoid với 09 hợp chất nhóm flavonol (quercetin, isorhamnetin, kaempferol, catechin, isoquercitrin, hyperin, quercitrin, quercetin 3-O-β-D-GlcA, rutin) và 02 hợp chất nhóm flavon (vitexin, scutellarein 7- O-β -D-GlcA methyl ester).
- 02 alkaloid là hợp chất mới (EN-4 và EN-5), lần đầu tiên được công bố phân lập từ hợp chất tự nhiên, cấu trúc được xác định và được đề nghị đặt tên là
isoliensinin N2’-oxid và isoliensinin N2-oxid.
- 05 hợp chất đã được công bố có trong những dược liệu khác nhưng lần đầu tiên được phân lập từ cây Sen: 02 alkaloid (pronuciferin N-oxid và apoglaziovin);
03 flavonoid (calycosin, scutellarein 7-O-β-D-GlcA methyl ester, vitexin).
- 02 alkaloid lần đầu tiên được công bố từ lá Sen (isoliensinin, norarmepavin);
03 alkaloid (nuciferin, armepavin, norarmepavin) và 03 flavonoid (isorhamnetin, quercitrin, quercetin 3-O-β-D-GlcA) lần đầu tiên được công bố từ tâm Sen.
136
- Phần lớn các alkaloid, flavonoid phân lập được từ lá, tâm Sen trong nghiên cứu này đều là lần đầu tiên được công bố tại Việt Nam (ngoại trừ: quercetin, isoquercitrin, nuciferin, neferin[7],[8], [9], [11])
Luận án đã góp phần xây dựng các bộ dữ liệu phổ học gồm phổ UV, IR, MS, NMR của 16 alkaloid, 12 flavonoid từ lá và tâm Sen, cơ sở dữ liệu phổ học quan trọng cho
các công trình nghiên cứu thành phần hóa học của cây Sen chi Nelumbo, họ Nelumboaceae.
2. Thiết lập chất đối chiếu
Độ tinh khiết của 35 hợp chất phân lập đã được xác định bằng phương pháp SKLM và HPLC/PDA. Tất cả đều có độ tinh khiết trên 95 %.
Lần đầu tiên 06 chất đối chiếu (nuciferin, 2-O-nornuciferin, liensinin, isoliensinin, neferin, quercetin 3-O-β-D-GlcA) có nguồn gốc từ các cao chiết lá và tâm Sen được thiết lập và công bố đạt yêu cầu CĐC hóa học thứ cấp với bộ dữ liệu chuẩn bao gồm điểm chảy, năng suất quay cực, phổ UV, IR, MS, NMR.
Tiêu chuẩn cơ sở của mỗi CĐC đã được Viện kiểm nghiệm thuốc Tp.HCM, Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc mỹ phẩm Tp.Cần Thơ thẩm định.
3. Quy trình định tính điểm chỉ, định lượng đồng thời các alcaloid, flavonoid có trong lá, tâm Sen
Xây dựng và thẩm định đạt yêu cầu 08 quy trình phân tích định tính, định lượng đồng thời các alkaloid hay flavonoid có trong nguyên liệu lá, tâm Sen bằng phương pháp HPLC/PDA và CE-PDA-MS, bao gồm:
- Qui trình định tính, định lượng đồng thời 04 alkaloid trong lá Sen bằng phương pháp HPLC-PDA.
- Qui trình định tính, định lượng đồng thời 08 flavonoid trong tâm Sen bằng phương pháp HPLC-PDA.
- Qui trình định tính, định lượng đồng thời 07 alkloid trong tâm Sen bằng phương pháp HPLC-PDA.
- Qui trình định tính, định lượng đồng thời 06 flavonoid trong tâm Sen bằng phương pháp HPLC-PDA và CE-PDA.
137
- Qui trình định tính, định lượng đồng thời 07 alkaloid trong lá Sen bằng phương pháp CE-PDA-MS.
- Qui trình định tính, định lượng đồng thời 08 flavonoid trong lá Sen bằng phương pháp CE-PDA.
- Qui trình định tính, định lượng đồng thời 09 alkaloid trong lá Sen bằng phương pháp CE-PDA-MS
Trong đó:
Hai qui trình định tính, định lượng bằng phương pháp CE-PDA-MS lần đầu tiên áp dụng cho các alkaloid khung aporphin, proaporphin, benzylisoquinolin,
bisbenzylisoquinolin có trong lá, tâm Sen được công bố.
Hai qui trình định tính, định lượng bằng phương pháp CE-PDA lần đầu tiên áp dụng
cho các flavonoid khung euflavonoid (flavonol, flavon, catechin) và isoflavonoid có trong lá và tâm Sen được công bố.
Các qui trình định tính, định lượng bằng phương pháp HPLC-PDA, tuy không mới về mặt kỹ thuật nhưng là lần đầu tiên được công bố với thành phần các alkaloid, flavonoid có trong mẫu.
Xác định đặc tính điểm chỉ của lá và tâm Sen
Lần đầu tiên xây dựng được các SKĐ và điện di đồ DVT bằng phương pháp SKLM, HPLC-PDA, CE-PDA/MS giúp xác định đặc tính điểm chỉ, nhận dạng lá, tâm Sen
của từng vùng miền tại Việt Nam.
4. Ứng dụng qui trình định lượng để đánh giá chất lượng nguồn nguyên liệu và các chế phẩm bào chế từ lá, tâm Sen
Các qui trình định tính, định lượng sau khi thẩm định đã được áp dụng để kiểm soát chất lượng 32 mẫu nguyên liệu lá Sen và 32 mẫu nguyên liệu tâm Sen (Nelumbo nucifera) được thu hái vào mùa thu hái khác nhau từ ba vùng miền khác nhau của
Việt Nam và mẫu nguyên liệu lá Sen loài Nelumbo lutea và loài Victoria regia (họ Súng). Từ đó đưa ra những khuyến cáo về chất lượng nguồn nguyên liệu lá, tâm
Sen có nhiều giá trị sinh học này cũng như các chế phẩm bào chế từ lá, tâm Sen đang lưu hành trên thị trường.
138
KIẾN NGHỊ
Các kết quả đạt được nêu trên là cơ sở khoa học để thực hiện các hướng nghiên cứu tiếp theo cho dược liệu lá, tâm Sen:
1. Trên kết quả các CĐC đã được thiết lập, các quy trình phân tích đã được thẩm định đã được báo cáo trong nội dung của luận án là những cơ sở khoa học để tiến hành xây dựng “Chuyên luận dược liệu lá, tâm Sen” cho Dược điển Việt Nam trong lần xuất bản tới.
2. Khảo sát qui trình chiết cao định chuẩn alkaloid, flavonoid có kiểm soát hàm lượng của các alkaloid, flavonoid có tác dụng sinh học đã được chứng minh. Từ đó, tiến
hành tối ưu hóa công thức bào chế viên nang chứa cao định chuẩn alkaloid, flavonoid.
3. Tiến hành thử nghiệm invivo trên các tác dụng mới đang rất được tâm là tác dụng về kháng khối u, kích thích miễn dịch của alkaloid khung bisbenzylisoquinolin có
trong tâm Sen và tác dụng hạ đường huyết của alkaloid khung aporphin có trong lá Sen.
139
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Nguyễn Đức Tuấn, Trần Hùng (2011), “Nghiên cứu thành phần alkaloid trong tâm sen (Nelumbo nucifera Gaertn Nelumbonaceae)”, Tạp chí Y học Tp.HCM, Tập 15 phụ bản của số 1, 2011, 606 - 611.
2. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Nguyễn Đức Tuấn, Trần Hùng (2011), “Xây dựng qui trình định lượng neferin trong cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen (Nelumbo
nucifera Gaertn Nelumbonaceae) bằng HPLC với đầu dò dãy diod quang”, Tạp chí Y học Tp.HCM, Tập 15 phụ bản của số 1, 2011, 628 - 632.
3. Do Chau Minh Vinh Tho, Le Ngoc Van Trang, Duong Thi Truc Ly, Nguyen Duc Tuan, Tran Hung (2011), “Simultaneous Quantitative Determination of Nuciferine and Neferine in Total Alkaloids Extract from Loti Embryo (Nelumbo nucifera Gaertn.) by HPLC with PDA Detector”, Proceeding of the seventh Indochina Conference on Pharmaceutical Sciences, Bangkok, Thailand, December 14-16, 2011, 409-412.
4. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Lữ Thiện Phúc, Mạch Khắc Duy (2012), “Xây dựng qui trình định lượng, định tính điểm chỉ một số alkaloid chính có trong tâm sen Việt Nam (Nelumbo nucifera Gaertn) bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò dãy diod quang”, Tạp chí Y học thực hành, số 852+853, 303-307.
5. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Nguyễn Thị Tường Vi, Nguyễn Thị Phương Cúc (2012),
“Xây dựng qui trình chiết cao chuẩn alkaloid lá sen (Nelumbo nucifera Gaertn)”, Tạp chí Y học thực hành, số 852+853, 315-319.
6. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Nguyễn Thị Xuân Thương, Trần Hùng, Nguyễn Đức Tuấn (2012), “Xây dựng quy trình định lượng đồng thời quercetin, kaempferol, catechin và
quercetin-3-O-glucuronid trong lá sen bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA”, Tạp chí Dược học số 3-2012, 17-21.
7. Do Chau Minh Vinh Tho, Nguyen Duc Tuan, Tran Hung, Markus Ganzera, Hermann Stuppner (2012), “Quantitative determination of phenolic compounds in Lotus
(Nelumbo nucifera) leaves by capillary zone electrophoresis”, Planta Medica, 78, 1796-1799.
8. Do Chau Minh Vinh Tho, Nguyen Duc Tuan, Tran Hung, Markus Ganzera, Hermann Stuppner (2013), “Analysis of alkaloids in Lotus (Nelumbo nucifera) leaves by non
140
aqueous capillary electrophoresis using ultraviolett and mass spectrometric detection”, Journal of Chromatography A, 1302, 174-180.
9. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Tô Yến Ngọc, Trần Hùng, Nguyễn Đức Tuấn (2013),
“Xây dựng quy trình định lượng đồng thời nuciferin, pronuciferin, o-nornuciferin và isoliensinin trong lá sen bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA”, Tạp chí Dược học số 5-2013, 27-31.
10. Do Chau Minh Vinh Tho, Nguyen Duc Tuan, Tran Hung, Markus Ganzera, Hermann Stuppner (2013), “Analysis of alkaloids in lotus (nelumbo nucifera gaertn.) embryo by non-aqueous capillary electrophoresis using ultraviolet and mass spectrometric detection”, Proceeding of the eighth Indochina Conference on Pharmaceutical Sciences, Ho Chi Minh city, Vietnam, December 4-5, 2013, 316-321.
11. Do Chau Minh Vinh Tho, Nguyen Duc Tuan, Tran Hung, Markus Ganzera, Hermann Stuppner (2013), “Isolation, purification and elucidation of bioactive alkaloids in plumula nelumbinis of Vietnam”, Proceeding of the eighth Indochina Conference on Pharmaceutical Sciences, Ho Chi Minh city, Vietnam, December 4-5, 2013, 938-943.
12. Do Chau Minh Vinh Tho, Nguyen Duc Tuan, Tran Hung, Markus Ganzera, Hermann Stuppner (2013), “Extraction, isolation and elucidation of several flavonoids in lotus leaves (nelumbo nucifera Gaertn.)”, Proceeding of the eighth Indochina Conference on Pharmaceutical Sciences, Ho Chi Minh city, Vietnam, December 4-5, 2013, 952-957.
13. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Huỳnh Phương Thảo, Trần Hùng (2014). “Nghiên cứu phân
lập các alkaloid có tác dụng sinh học trong lá sen (Nelumbo nucifera Gaertn.)”.
Tạp chí Y học thực hành, số 944-2014, 49-52.
-1-