Kết quả nghiên cứu sàng lọc tác dụng bảo vệ gan ở trên cho thấy có nhiều vị thuốc có triển vọng nghiên cứu làm thuốc điều trị viêm gan mạn do virút VGB như: lá ban tròn, quả ngũ vị, quả dứa gai, lá muồng trâu, quả khúng khéng. Tuy nhiên xét về góc độ nguồn nguyên liệu thì một số vị còn hạn chế.
Quả khúng khéng có tác dụng khá tốt trên cả 2 chỉ tiêu thí nghiệm enzym GPT và hàm lượng bilirubin nhưng cây khúng khéng là cây nhập nội, hiện nay chỉ còn một số ít cây ở Cao Bằng, người dân địa phương trồng trong vườn nhà để lấy quả làm thuốc bổ dưỡng, chữa tiêu hoá kém...
Quả ngũ vị hoa nam được thu hái tại núi Ngọc Linh tỉnh Kon Tum. Theo báo cáo của VDL thì cây ngũ vị hoa nam có trữ lượng khá lớn tại vùng núi Ngọc Linh thuộc hai tỉnh Kon Tum và Quảng Nam (ước tính khoảng 4,5 - 5,0 tấn quả khô/năm) nhưng khi cần thu mua quả ngũ vị đạt tiêu chuẩn để nghiên cứu thì rất khó khăn. Người dân địa phương thu hái quả ngũ vị còn non, chất lượng kém không thể làm thuốc. Hàm lượng lignan toàn phần tính theo Gomisin C trong quả ngũ vị thu hái năm 2008 chỉ đạt 2,65%, trong khi trong quả ngũ vị thu hái năm 2006 là 3,82%. Nếu nghiên cứu thành công cũng không có nguyên liệu với chất lượng ổn định để sản xuất thuốc.
Quả dứa gai cũng là vị thuốc tốt trong điều trị các bệnh về gan mật theo kinh nghiệm nhân dân. Trong thí nghiệm trên chuột gây viêm gan cấp, cao nước quả dứa gai với liều thấp 0,65g/kg thể trọng chuột, có tác dụng giảm enzym GPT và hàm lượng bilirubin tương đương silymarin (bảng 3.1). Tuy nhiên nguyên liệu quả dứa gai cũng không nhiều trong tự nhiên, hoàn toàn thu hái hoang dại ở một số tỉnh phía Nam và phía Bắc. Vì vậy cũng không thể chọn quả dứa gai để tiếp tục nghiên cứu.
Lá cây ban tròn - một cây thuốc có nhiều ở vùng núi phía Bắc và miền Trung. Viện Dược liệu đã đầu tư nghiên cứu toàn diện về cây ban tròn: từ xác định tên khoa học, sự phân bố trong tự nhiên, kỹ thuật nhân trồng cây ban tròn tại Sa Pa và nghiên cứu quy trình điều chế astilbin từ lá ban tròn làm chất đối chiếu dùng trong kiểm nghiệm dược liệu, bán
thành phẩm và thuốc từ lá ban tròn. Vì vậy lá ban tròn là đối tượng nghiên cứu có nhiều thuận lợi để sản xuất thuốc nếu nghiên cứu thành công.
Kết quả thử tác dụng bảo vệ gan của cao cồn lá ban tròn và chế phẩm flavonoid toàn phần cũng như các thành phần astilbin và quercitrin chiết xuất từ cao cồn lá ban tròn cho thấy tất cả các chế phẩm này đều có tác dụng bảo vệ tế bào gan tốt với các liều thử rất thấp (0,02g/kg) (bảng 3.1). Liều có tác dụng thấp và tác dụng bảo vệ gan tốt - là những điểm nổi trội của các chế phẩm từ lá ban tròn - thuận lợi cho nghiên cứu dạng bào chế mới và giảm liều sử dụng trong điều trị sau này. Vì thế flavonoid toàn phần từ lá ban tròn đã được chọn để tiếp tục nghiên cứu. Astilbin và quercitrin có thể là những chất chỉ điểm để nhận dạng dược liệu, nhận dạng bán thành phẩm trong thuốc mới nếu nghiên cứu thành công..
Lá muồng trâu đã được đưa vào DĐVN III với công dụng chữa phù thũng, đau gan, vàng da nhưng cho đến nay chưa có công trình nào ở trong và ngoài nước côg bố về tác dụng của lá muồng trâu trên viêm gan cấp và mạn tính. Kết quả thử tác dụng bảo vệ gan của đề tài cho thấy cao nước của lá muồng trâu có tác dụng bảo vệ gan khá tốt với liều thử không cao (1,3g/kg thể trọng chuột nhắt trắng) (bảng 3.1). Vì vậy cao nước của lá muồng trâu cũng được chọn để nghiên cứu tiếp trên mô hình gây viêm gan mạn.
Bài thuốc số 2 có tác dụng bảo vệ gan tương đương chế phẩm silymarin và tác dụng tốt hơn bài thuốc số 1. Thành phần của bài thuốc số 2 gồm các vị hạ khô thảo (40 g), mã đề (40 g), thổ phục linh (12 g), nghệ vàng (10g) và rau má (40g) - là các vị thuốc được sử dụng trong nhân dân làm thuốc trị viêm gan B mạn tính. Gần đây các vị thuốc này đã được chứng minh có tác dụng chống viêm gan (hạ khô thảo, thổ phục linh, rau má, nghệ), kháng virut viêm gan B (mã đề) trên thực nghiệm [33]. Vì vậy bài thuốc số 2 được chọn để tiếp tục nghiên cứu so sánh với 2 chế phẩm độc vị là flavonoid từ lá ban tròn và cao nước lá muồng trâu.
Như vậy, 3 chế phẩm được chọn để tiếp tục nghiên cứu trên mô hình gây viêm gan mạn ở chuột cống trắng bằng CCl4 tiêm dài ngày gồm: chế phẩm flavonoid toàn phần chiết xuất từ lá ban tròn, cao nước lá muồng trâu và bài thuốc số 2.
3.3.1-Kết quả thử tác dụng bảo vệ gan của 3 chế phẩm trên chuột bị gây viêm gan mạn bằng CCl4:
Tác dụng bảo vệ gan của các chế phẩm trên chuột bị gây viêm gan mạn bằng CCl4
được đánh giá dựa vào tác dụng làm giảm hoạt tính của các enzym gan GOT và GPT và hàm lượng bilirubin. Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.7.
Bảng 3.7: Tác dụng của các chế phẩm trên GOT, GPT và bilirubin
GOT (U/l) GPT (U/l) Bilirubin (àmol/l) Lô thử
M ± SE So chứng M ± SE So chứng M ± SE So chứng Cao nước muồng trâu và bài thuốc số 2
1 Chứng sinh lý (n = 12)
157,53
±15,18
43,79
± 1,98
11,67
± 0,49 2 Chứng gây
bệnh (n=12)
249,40
± 9,58
↑ 58,32%
< 0,001
116,8
± 10,25
↑166,73%
< 0,001
15,59
± 0,85
↑33,59%
< 0,001 3 Muồng trâu
1290mg/kg (n = 12)
208,54
± 21,10
↓ 16,38%
> 0,05
111,80
± 18,77
↓ 4,28%
> 0,05
14,90
± 0,91
↓ 4,43%
> 0,05
4 Bài thuốc 2:
2070mg/kg (n = 11)
237,04
± 19,28
↓ 4,96%
> 0,05
110,37
± 15,32
↓ 5,51%
> 0,05
15,81
± 0,93
↑1,41%
> 0,05
Flavonoid Ban tròn 5 Chứng sinh
lý (n = 10)
88,46 ± 6,86
30,04 ± 2,19
19,26 ± 0,57 6 Chứng gây
bệnh (n=10)
215,98 ± 22.38
↑ 144,16%
< 0,01
201,31 ± 26,0
↑570,14%
< 0,01
27,09 ± 1.62
↑40,65%
< 0,01 7 Flavonoid
Ban tròn 125mg/kg
(n=11)
164,37 ± 24,99
↓ 23,9%
> 0,05
150.10 ± 20,69
↓ 25,44%
> 0,05
26,56 ± 1,55
↓1,96%
> 0,05
8 Flavonoid Ban tròn 250mg/kg
(n=10)
158,46 ± 20,46
↓ 26,63%
> 0,05
165,86 ± 13,36
↓ 17,61%
> 0,05
24,27 ± 1,02
↓ 10,41%
> 0,05
Ghi chú: ↓: Giảm ↑: Tăng Nhận xét:
- Mức độ tăng hoạt độ men GOT; GPT và nồng độ bilirubin trong huyết thanh của lô chứng gây bệnh so với lô chứng sinh lý rất có ý nghĩa thống kê (P<0.01), điều đó chứng tỏ lô gây bệnh đạt yêu cầu bệnh lý để thử tác dụng của các mẫu thử.
-Chế phẩm flavonoid ban tròn với liều 125mg/kg và 250mg/kg/ngày có tác dụng làm giảm nhiều nhất hoạt độ enzym GOT (23,9 - 26,3%), GPT (17,61 - 25,44%) và nồng độ Bilirubin (10,41%) trong huyết thanh, tuy nhiên sự giảm này chưa có ý nghĩa thống kê (P>0.05).
- Cao nước muồng trâu chỉ có tác dụng tốt trên GOT (giảm 16,38%), tác dụng yếu trên GPT (giảm 4,28%) và bilirubin (giảm 4,43%). Kết quả này cũng chưa có ý nghiã thống kê.
- Bài thuốc 2 thể hiện tác dụng bảo vệ gan yếu trong viêm gan mạn, làm giảm không đáng kể hoạt độ GOT (4,69%); GPT (5,51%) và làm tăng 1,41% nồng độ bilirubin trong huyết thanh (P>0,05).
3.3.2- Tác dụng trên colagen:
Ngăn chặn các nguyên nhân dẫn đến xơ gan - là một trong các mục tiêu của thuốc điều trị viêm gan mạn do virút VGB. Sự tích tụ colagen trong gan là dấu hiệu của sự xơ gan. Vì vậy hàm lượng colagen trong gan được dùng làm chỉ tiêu đánh giá mức độ xơ gan ở chuột bị gây viêm gan mạn bằng hóa chất. Thuốc có tác dụng làm giảm hàm lượng colagen trong gan chuột bị gây viêm gan mạn được cho là thuốc có tác dụng hạn chế các nguyên nhân dẫn đến xơ gan, ức chế quá trình tiến triển của xơ gan [19, 41, 57].
Kết quả xác định tác dụng của 3 chế phẩm trên hàm lượng colagen ở chuột bị gây viêm gan mạn bằng CCl4 được trình bày ở bảng 3.8.
Bảng 3.8 : Tác dụng ức chế quá trình tạo colagen/gan của các lô thử
STT Lô thử n Hàm lượng
colagen (mg/100g gan tươi)
% so chứng
P
Muồng trâu và bài thuốc số 2 1 Chứng sinh lý 12 137,14 ± 3,59
2 Chứng gây bệnh 12 201,55 ± 2,99 ↑ 46,97 < 0,001 3 Muồng trâu
1290mg/kg
11 176,07 ± 7,21 ↓ 12,64 < 0,01
4 Bài thuốc số 2 2070mg/kg
11 190,08 ± 6,84 ↓ 5,69 > 0,05
Flavonoid Ban tròn 5 Chứng sinh lý 10 118.98 ± 5.62
6 Chứng gây bệnh 10 195.60 ± 3.51 ↑ 64.40 < 0,001 7 Flavonoid Ban tròn
125mg/kg
11 174.55 ± 8.88 ↓ 10.76 < 0,05
8 Flavonoid Ban tròn 250mg/kg
10 165.78 ± 5.25 ↓ 15.24 < 0,001
Nhận xét:
- Hàm lượng colagen trong gan giữa lô chứng sinh lý và lô gây bệnh khác nhau rất có ý nghĩa thống kê (P<0.001). Điều này cho thấy mô hình gây tăng quá trình tạo colagen trong gan đạt yêu cầu gây nên trạng thái bệnh lý để thử tác dụng của thuốc.
- Flavonoid ban tròn với liều 125mg/kg và 250mg/kg/ngày đều có tác dụng làm giảm Hàm lượng colagen trong gan (10,76% và 15,24% tương ứng) và tác dụng này có ý nghĩa
trình xơ gan cao hơn lô chuột uống với liều 125mg/kg nhưng sự khác nhau về tác dụng giữa 2 liều này là không có ý nghĩa thống kê (P > 0.05).
- Cao nước muồng trâu có tác dụng làm giảm hàm lượng colagen trong gan (12,64%) và tác dụng này có ý nghĩa thống kê.
- Bài thuốc 2 tuy có làm giảm 5,69% hàm lượng colagen trong gan nhưng không có ý nghĩa thống kê.
3.3.3-Tác dụng chống oxy hoá:
Tác dụng chống oxy hóa được coi là một trong các cơ chế bảo vệ tế bào gan của các chế phẩm thuốc điều trị viêm gan mạn tính. Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa thông qua tác dụng ức chế quá trình tích tụ sản phẩm của quá trình oxy hóa là MDA được trình bày ở bảng 3.9.
Bảng 3.9: Tác dụng ức chế quá trình oxy hoá
Lô thử n Hàm lượng MDA % so chứng P
Muồng trâu và bài thuốc số 2 1 Chứng sinh lý 12 2,78 ± 0,31
2 Chứng gây bệnh 12 6,24 ± 0,38 ↑ 124,46 < 0,001 3 Muồng trâu
1290mg/kg
12 5,66 ± 0,39 ↓ 9,30 > 0,05
4 Bài thuốc số 2 2070mg/kg
11 5,40 ± 0,35 ↓ 13,46 > 0,05
Flavonoid Ban tròn
5 Chứng sinh lý 10 2,49 ± 0.29 - -
6 Chứng gây bệnh 10 4,77 ± 0.40 ↑ 91,57 < 0,001 7 Flavonoid Ban
tròn 125mg/kg
11 3,75 ± 0.41 ↓ 21,38 < 0,05
8 Flavonoid Ban tròn 250mg/kg
10 4,12 ± 0.42 ↓ 13,63 < 0,05
Nhận xét:
- Nồng độ MDA trong gan giữa lô chứng sinh lý và lô gây bệnh khác nhau có ý nghĩa thống kê. Điều này cho thấy mô hình gây tăng quá trình oxy hoá đạt yêu cầu gây trạng thái bệnh lý để thử tác dụng của thuốc.
- Flavonoid ban tròn với liều 125mg/kg và 250mg/kg/ngày đều có tác dụng ức chế quá trình oxy hoá và tác dụng này có ý nghĩa thống kê. Lô chuột uống với liều 125mg/kg có tác dụng ức chế quá trình oxy hoá hơn lô chuột uống với liều 250mg/kg.
- Cao nước muồng trâu và bài thuốc số 2 có làm giảm nồng độ MDA trong gan, tuy nhiên sự giảm này chưa có ý nghĩa thống kê.
Từ các kết qủa trình bày ở các bảng 3.7; 3.8; 3.9 cho thấy chế phẩm flavonoid ban tròn có tác dụng làm giảm GOT, GPT, bilirubin, colagen và MDA tốt hơn chế phẩm lá muồng trâu và bài thuốc số 2. Vì vậy chúng tôi đã tiến hành xét nghiệm mô học gan chuột thí nghiệm của lô gây viêm gan mạn được điều trị bằng flavonoid ban tròn so sánh với lô chuột bị gây viêm gan mạn nhưng không được điều trị.
3.3.4-Kết quả mô học hình ảnh tế bào gan chuột thí nghiệm:
Kết quả xét nghiệm mô học được ghi bằng hình ảnh tại các hình từ hình 3.1 hình 3.14 cho thấy chế phẩm flavonoid đã thể hiện tác dụng bảo vệ gan và ức chế xơ gan rõ rệt.
Như đã biết xơ gan là qúa trình không đảo ngược nhưng nếu ngăn chặn được các nguyên nhân dẫn đến xơ gan thì có thể làm chậm sự tiến triển của xơ gan. Một trong các nguyên nhân dẫn đến xơ gan là viêm gan mạn và thoái hóa mỡ của tế bào gan. Nếu loại bỏ sớm được các nguyên nhân này thì có thể không dẫn đến xơ gan hoặc hạn chế được sự phát triển của xơ gan.
Hình ảnh các tế bào gan bị thoái hóa mỡ nặng nề và hình ảnh xơ gan rõ rệt của lô chuột bệnh lý cho thấy mô hình gây xơ gan bằng CCl4 đạt yêu cầu.
So sánh tổ chức tế bào gan đại thể và cấu trúc vi thể gan chuột bị gây xơ gan bằng
cho thấy flavonoid ban tròn đã thể hiện tác dụng bảo vệ gan, tuy không giúp hồi phục hoàn toàn nhưng đã cải thiện các tổn thương gan rõ rệt. Đặc biệt đã hạn chế mức độ phát triển của xơ gan rất nhiều so với lô chuột bệnh lý không được điều trị: ba trong số 4 chuột bệnh lý không có hình ảnh xơ gan. Đây là kết quả đáng ghi nhận đối với chế phẩm flavonoid chiết tách từ lá cây ban tròn. Dưới đây là hình ảnh gan chuột lô sinh lý, lô bệnh lý không điều trị và lô bệnh lý điều trị bằng flavonoid ban tròn.
Hình ảnh gan chuột của lô sinh lý: Tế bào gan không có thoái hóa và không có hoại tử. Khoang cửa không có tăng sinh liên kết xơ, không xâm nhập viêm (Hình 3.1 và 3.2).
Gan bình thường.
Hình ảnh gan chuột của lô gây xơ gan không được điều trị:
-Hình ảnh gan chuột số 3: Hầu hết tế bào gan thoái hóa mỡ, thoái hóa nước. Tế bào nở to, bào tương rộng, nhân teo nhỏ. Đặc biệt mô liên kết xơ tăng sinh mạnh, quây quang các tiểu thùy gan, chia rẽ các tiểu thùy, có các tiểu thùy tân tạo, không có tĩnh mạch trung tâm. Kết luận: Hình ảnh xơ gan (hình 3.3 và 3.4).
-Hình ảnh gan chuột số 4: Khoảng 90% tế bào gan bị thoái hóa mỡ, nước với các hốc từ nhỏ đến to và rất to. Khoảng cửa mô liên kết tăng sinh chia rẽ các tiểu thùy gan, nối cửa - cửa, cửa -trung tâm. Có các tiểu thùy tân tạo. Kết luận: Hình ảnh xơ gan (hình 3.5 và 3.6).
Hình 3.1: Cấu trúc vi thể gan chuột 1 của lô sinh lý (nhuộm 2 màu) (x 400)
Hình 3.3: Cấu trúc vi thể gan chuột 3 của lô gây bệnh (nhuộm 2 màu) (x 100)
Hình 3.4: Cấu trúc vi thể gan chuột 3 của lô gây bệnh (nhuộm 3 màu) (x 100)
Hình 3.5: Cấu trúc vi thể gan chuột 4 của lô gây bệnh (nhuộm 2 màu) (x 100)
Hình 3.6: Cấu trúc vi thể gan chuột 4 của lô gây bệnh (nhuộm 3 màu) (x 100)
Hình ảnh gan chuột của lô gây viêm gan mạn và xơ gan được điều trị bằng flavonoid ban tròn:
*Liều dùng flavonoid: 125mg/kg
- Hình ảnh gan chuột số 5: Tế bào bị thoái hóa mỡ, nước nặng,các hốc lớn chiếm ưu thế.
Mô liên kết tăng sinh lan tỏa nhưng chưa gây đảo lộn cấu trúc hoàn toàn. Kết luận: Xơ hóa lan tỏa nhưng chưa tạo xơ gan điển hình (hình 3.7 và 3.8).
- Hình ảnh gan chuột số 7: Khoảng 80% tế bào gan bị thoái hóa mỡ, hốc mỡ tương đối lớn. Các khoang cửa liên kết tăng sinh vừa, xâm lấn một phần vào tiểu thùy gan, hoặc nối khoang cửa - cửa ở một số vùng. Kết luận: Xơ tăng sinh nhưng chưa tạo xơ gan (hình 3.9 và 3.10).
*Liều dùng flavonoid: 250mg/kg
- Hình ảnh gan chuột số 8: Khoảng 80% tế bào gan bị thoái hóa mỡ, các hốc mỡ từ nhỏ đến to, trong đó mức độ vừa chiếm ưu thế. Mô liên kết tăng sinh lan tỏa nối các khoang cửa - cửa, chia rẽ các tiểu thùy gan và vây quanh các tiểu thùy tân tạo. Kết luận: Hình ảnh xơ gan (hình 3. 11 và 3.12).
- Hình ảnh gan chuột số 10: Khoảng 80% tế bào gan bị thoái hóa mỡ, các hốc mỡ từ nhỏ đến to. Trong đó hốc trung bình chiếm ưu thế. Mô liên kết tăng sinh xâm lấn vào tiểu thùy gan, nối giữa khoảng cửa - cửa nhưng chưa tạo thành xơ gan vòng. Kết luận: Tăng sinh liên kết xơ mức độ vừa nhưng chưa tạo thành xơ gan (hình 3.13 và 3.14).
Hình 3.7: Cấu trúc vi thể gan chuột 5 của lô flavonoid ban tròn 125mg/kg (nhuộm 2 màu) (x 100)
Hình 3.8: Cấu trúc vi thể gan chuột 5 của lô flavonoid ban tròn 125mg/kg (nhuộm 3 màu) (x 100)
Hình 3.9: Cấu trúc vi thể gan chuột 7 của lô flavonoid ban tròn 125mg/kg (nhuộm 2 màu) (x 100)
Hình 3.10: Cấu trúc vi thể gan chuột 7 của lô flavonoid ban tròn 125mg/kg (nhuộm 3 màu) (x 100)
Hình 3.11: Cấu trúc vi thể gan chuột 8 của lô flavonoid ban tròn 250mg/kg (nhuộm 2 màu) (x 100)
Hình 3.13: Cấu trúc vi thể gan chuột 10 của lô flavonoid ban tròn 250mg/kg (nhuộm 2 màu) (x 100)
Hình 3.14: Cấu trúc vi thể gan chuột 10 của lô flavonoid ban tròn 250mg/kg (nhuộm 3 màu) (x 100)
3.4- Kết quả thử một số tác dụng hỗ trợ điều trị viêm gan của 3 chế phẩm 3.4.1- Kết quả thử tác dụng chống viêm mạn của 3 chế phẩm
Khi gan bị nhiễm độc thường xảy ra qúa trình viêm. Lúc đầu là viêm cấp, nếu không được chữa trị sẽ chuyển thành viêm mạn tính. Vì vậy tác dụng chống viêm cũng là một trong các cơ chế tác dụng của thuốc điều trị viêm gan. Kết quả so sánh tác dụng chống viêm mạn của 3 chế phẩm cao nước muồng trâu, flavonoid ban tròn và bài thuốc số 2 được trình bày ở bảng 3.10.
Bảng 3.10: So sánh tác dụng chống viêm mạn của các mẫu với lô chứng
STT Lô thử n Trọng lượng trung
bình ổ viêm (mg)
% giảm so với lô chứng
P so với lô chứng 1 Lô đối chứng 6 438,7 ± 23,2
2 Muồng trâu (1290mg/kg)
7 322,0 ± 9,1 26,6 < 0,05
3 Bài thuốc số 2 (2070mg/kg)
6 334,3 ± 17,7 23,8 < 0,05
4 Flavonoid ban tròn (250mg/kg)
6 335,8 ± 10,6 23,5 < 0,05
5 Lô Prednisolon 6 278,6 ± 13,3 36,5 < 0,05
Nhận xét: Từ bảng trên cho thấy: Cả 3 mẫu thử đều có tác dụng chống viêm mạn trên mô hình gây u hạt thực nghiệm bằng amian. Tác dụng chống viêm mạn của 3 mẫu thử tương đương nhau, tức là có tác dụng làm giảm trọng lượng u hạt gần như nhau (từ 23,5 đến 26,6%). Tác dụng giảm này có ý nghĩa thống kê (P < 0,05).
Trong thí nghiệm, có mẫu thử tham chiếu là prednisolon. Tác dụng chống viêm mạn của Prednisolon cao hơn 3 mẫu thử trên khi cho chuột uống với liều là 5 mg/ kg thể trọng.