Chương VIII: Chương VIII: Qui định những hồ sơ kèm theo
IV- BÀN LUẬN KẾT QUẢ
4.1-Kết quả sàng lọc vị thuốc, bài thuốc có tác dụng bảo vệ gan:
Tổng hợp tư liệu về nghiên cứu thuốc điều trị VGM do virut từ các vị thuốc và các bài thuốc thảo mộc của các tác giả ở trong và ngoài nước cho thấy nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của thuốc được tiến hành theo mô hình sau:
• Khảo sát tác dụng bảo vệ gan:
Tác dụng bảo vệ gan của thuốc được đánh giá dựa trên tác dụng ngăn ngừa các tổn thương gan có thể xảy ra do các tác nhân độc hại cho gan. Các tác nhân độc hại thường được sử dụng như: CCl4, paracetamol, ethanol, methanol, alpha amanitin, D- galactosamine, aflatoxin B, plasmodium berghei, thioacetamide, trong đó CCl4, paracetamol, ethanol được sử dụng nhiều nhất. Các tác nhân độc hại này gây huỷ hoại tế bào gan theo các cơ chế khác nhau.Trong thí nghiệm nghiên cứu của đề tài này chúng tôi dùng CCl4 làm tác nhân gây độc gan. Đây là một tác nhân gây độc gan kinh điển. Khi vào cơ thể CCl4 gây độc chủ yếu ở gan, gây huỷ hoại tế bào gan và có sự gia tăng hoạt tính của các enzyme gan Glutamic oxaloacetate transaminase (GOT), Glutamic pyruvic transaminase (GPT), gia tăng hàm lượng bilirubin trong huyết thanh. Các chất chuyển hoá trung gian của CCl4 tạo ra các gốc tự do kết hợp với lipid và protein trên hệ lưới nội mô của tế bào gan, gây ra một loạt các phản ứng peroxy hoá lipid, dẫn đến phá huỷ cấu trúc và chức năng của hệ lưới này. Gan bị tổn thương gây rối loạn quá trình bài xuất bilirubin làm cho nồng độ bilirubin trong máu tăng lên. Thuốc có tác dụng bảo vệ gan là thuốc có tác dụng làm giảm sự gia tăng các trasaminase và bilirubin trong huyết thanh.
Các vị thuốc và bài thuốc đưa vào nghiên cứu được chọn lọc dựa trên kinh nghiệm sử dụng trong Y học cổ truyền (YHCT) hoặc trong dân gian. Mười vị thuốc được chọn gồm:
• Cam thảo dây
• Diệp hạ châu (chó đẻ răng cưa)
• Lá muồng trâu
• Lá ban tròn
• Nọc sởi
• Ngũ vị tử hoa nam
• Quả dứa gai
• Quả khúng khéng
• Rễ cốt khí
Hai bài thuốc được chọn là:
1) Bài thuốc chữa viêm gan siêu vi khuẩn thể cấp tính [27]: Hạ khô thảo (30 g), ý dĩ (20 g), gừng khô (3 lát), dành dành (12 g), Hoài sơn (20 g), thổ phục linh (12 g), sâm bố chính (20 g), mã đề (10 g), trần bì (6 g). Sắc uống ngày 1 thang.
2) Bài thuốc chữa viêm gan siêu vi khuẩn thể mạn tính [ 27]: Hạ khô thảo (40 g); thổ phục linh (12 g), nghệ vàng (10 g), mã đề (40 g), rau má (40 g). Sắc uống ngày 1 thang.
Để định hướng cho chiết xuất chế phẩm làm thuốc sau này, các vị thuốc được chiết xuất với 3 dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, cồn 80% và nước. Riêng bài thuốc được chiết bằng nước theo kinh nghiệm sử dụng trong YHCT. Ngoài các chế phẩm cao toàn phần nêu trên, chế phẩm flavonoid toàn phần và 2 thành phần chính của chế phẩm này là astilbin và quercitrin đã được chiết tách từ dịch chiết cồn của lá ban tròn - là chế phẩm có tác dụng bảo vệ gan tốt và có nhiều triển vọng làm thuốc điều trị viêm gan mạn do siêu vi B đã được thử tác dụng bảo vệ gan.
Nghiên cứu được so sánh với thuốc tham chiếu Silymarin - một thuốc bảo vệ gan điển hình chiết xuất từ quả cúc gai [Silybum marianum (L.) Gaertn.] [56]. Các chế phẩm có tác dụng làm giảm có ý nghĩa thống kê đồng thời enzym GPT và hàm lượng bilirubin trong huyết thanh chuột bị gây tăng bởi CCl4 bằng hoặc hơn silymarin được coi là có tác dụng bảo vệ gan tốt. Các vị thuốc có ít nhất 1 dịch chiết (n-hexan, cồn hoặc nước) có tác dụng làm giảm có ý nghĩa thống kê đồng thời enzym GPT và hàm lượng bilirubin trong huyết thanh chuột bị gây tăng bởi CCl4 bằng hoặc hơn silymarin được coi là có tác dụng bảo vệ gan tốt.
Kết quả cho thấy 14/27 chế phẩm có tác dụng bảo vệ gan, đó là các chế phẩm:
• Cao cồn, cao nước, flavonoid toàn phần, astilbin, quercitrin chiết xuất từ lá ban tròn.
• Cao cồn - từ rễ cốt khí.
• Cao nước và cao cồn từ quả dứa gai, quả khúng khéng, lá vọng cách
• Cao nước từ lá muồng trâu, quả ngũ vị và 2 bài thuốc.
Các chế phẩm này đã làm giảm có ý nghĩa thống kê từ 26,53 đến 73,58% hoạt độ GPT và giảm từ 31,22 đến 65,06% hàm lượng bilirubin bị gây tăng bởi CCl4. Trong khi đó chế phẩm Silymarin với liều 100mg/kg thể trọng chuột đã làm giảm 43,84 % GPT và 43,88%
bilirubin bị gây tăng bởi CCl4 (bảng 3.1).
Các vị thuốc có tác dụng bảo vệ gan tốt gồm có:
• Lá ban tròn.
• Rễ cốt khí
• Quả dứa gai.
• Quả khúng khéng.
• Lá muồng trâu.
• Quả ngũ vị.
• Lá vọng cách.
Các vị thuốc này làm giảm có ý nghĩa thống kê hoạt tính của enzym GPT từ 26,53 đến 73,58% và giảm từ 31,22 đến 65,06% hàm lượng bilirubin bị gây tăng bởi CCl4 (bảng 3.1).
Hai bài thuốc số 1 và 2 đều có tác dụng bảo vệ gan tương đương với silymarin (liều 100mg/kg thể trọng chuột), làm giảm có ý nghĩa thống kê hoạt tính của enzym GPT từ 46,08 đến 57,54% và giảm từ 46,63 đến 44,98% hàm lượng bilirubin bị gây tăng bởi CCl4
(bảng 3.1).
Một số nhận xét cũng được ghi nhận từ kết quả thử sàng lọc tác dụng bảo vệ gan:
- Các chế phẩm chiết bằng nước có tác dụng bảo vệ gan tốt hơn các chế phẩm chiết bằng n-hexan và bằng cồn 80%, thể hiện tác dụng làm giảm có ý nghĩa thống kê cả 2 chỉ số enzym GPT và bilirubin: Cao nước của các vị thuốc: Lá Ban tròn, quả dứa gai, quả khúng khéng, lá muồng trâu, quả ngũ vị, lá vọng cách.
- Các chế phẩm có tác dụng bảo vệ gan tốt nhất, làm giảm có ý nghĩa thống kê cả 2 chỉ số enzym GPT và bilirubin: Cao nước, cao cồn, flavonoid toàn phần, quercitrin và astilbin của lá ban tròn, cao nước quả dứa gai, cao nước và cao cồn quả khúng khéng, cao nước lá muồng trâu, cao nước quả ngũ vị. Trong đó đặc biệt là cao cồn, flavonoid toàn phần, quercitrin và astilbin của lá ban tròn với liều thử rất thấp (0,207; 0,020g/kg) nhưng lại có tác dụng giảm hoạt độ của enzym GPT tương đương tác dụng của chế phẩm silymarin (0,100g/kg) và tác dụng giảm hàm lượng bilirubin tốt hơn silymarin.
- Kết quả trên cũng cho thấy kinh nghiệm của nhân dân sử dụng các vị thuốc và 2 bài thuốc trên trong điều trị các bệnh về gan là có căn cứ.
4.2- Kết quả sàng lọc vị thuốc, bài thuốc có tác dụng chống viêm gan mạn và ức chế xơ gan
Các chế phẩm có tác dụng bảo vệ gan tốt nhất được chọn để tiếp tục nghiên cứu về hoá học và đánh giá tác dụng ức chế xơ hoá gan. Tiêu chí để lựa chọn như sau:
- Tác dụng bảo vệ gan tốt.
- Liều dùng thấp.
-Nguồn nguyên liệu dồi dào, dễ thu hái trong tự nhiên hoặc trồng trọt.
Ba chế phẩm đáp ứng các yêu cầu trên là:
• Flavonoid chiết xuất từ lá ban tròn.
• Cao nước từ lá muồng trâu.
• Cao nước của bài thuốc số 2 (đại diện cho bài thuốc để so sánh với các chế phẩm độc vị).
*Sàng lọc tác dụng ức chế xơ gan:
Như đã biết viêm gan mạn do virút VGB gây ra những hậu quả nghiêm trọng, trong đó nghiêm trọng và nguy hiểm nhất là biến chứng xơ gan và ung thư gan. Đây là nguyên nhân chính gây tỷ lệ tử vong cao ở bệnh nhân viêm gan mạn do virut VG thể hoạt động.
Tỷ lệ khoảng 10 đến 40% bệnh nhân bị viêm gan B mạn hoạt động tiến triển thành xơ gan. Xơ gan sau viêm gan virut là xơ gan sau hoại tử. Xơ gan là quá trình không đảo ngược, không thể chữa trị nhưng có thể hạn chế các nguyên nhân dẫn đến xơ gan. Vì vậy một trong các tác dụng của các thuốc điều trị viêm gan mạn do virut VGB là tác dụng ngăn ngừa các nguyên nhân dẫn đến xơ gan, tức là ức chế quá trình xơ hoá gan. Tác dụng này được đánh giá trên mô hình gây viêm gan mạn bằng gây độc gan dài ngày bằng CCl4
[55]. Chỉ tiêu đánh giá là hàm lượng colagen trong gan - biểu hiện mức độ xơ gan.
Kết quả khảo sát tác dụng của 3 chế phẩm trên chuột cống trắng bi gây viêm gan mạn và xơ gan cho thấy cả 3 chế phẩm đều làm giảm hàm lượng colagen trong gan chuột nhưng chỉ có 2 chế phẩm có tác dụng giảm hàm lượng colagen trong gan có ý nghĩa thống kế so với lô không điều tri (bảng 3.7):
-Cao nước lá muồng trâu (liều thử 1,21g/kg): giảm 12,64% colagen (P< 0,01).
-Flavonoid toàn phần lá ban tròn (liều thử 0,125g/kg): giảm 10,76% (P<0.05) -Flavonoid toàn phần lá ban tròn (liều thử 0,250g/kg): giảm 15,24% (P<0,001) -Cao nước bài thuốc số 2 (liều thử 2,07g/kg): giảm 5,69% (P>0,05).
Như vậy cao nước lá muồng trâu và flavonoid lá ban tròn là các chế phẩm có tác dụng ức chế xơ hoá gan khá tốt. Lá muồng trâu đã được đưa vào DĐVN III làm vị thuốc chủ trị đau gan, vàng da nhưng hoàn toàn chưa được nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu này cho thấy lá muồng trâu là vị thuốc có triển vọng trong nghiên cứu làm thuốc ức chế xơ gan trong điều trị viêm gan siêu vi B mạn. Tuy nhiên đây là chế phẩm cao toàn phần, có nhiều tạp chất chưa xác định về hoá học vì vậy cần tiếp tục nghiên cứu thêm.
Chế phẩm flavonoid lá ban tròn là chế phẩm chiết xuất tương đối tinh khiết, gồm hỗn hợp các flavonoid - là các chất đã được nhiều công trình nghiên cứu chứng minh có nhiều tác dụng tốt trên gan:
- Chống oxy hoá, quét gốc tự do, chống peroxy hoá lipid.
- Điều hoà tính thấm của màng tế bào.
- Kích thích tổng hợp protein giúp tái sinh tế bào gan.
- Ức chế quá trình xơ hoá gan.
Hoạt tính của flavonoid chủ yếu là nhờ trong cấu trúc hoá học của chúng có vòng thơm, hệ nối đôi liên hợp, nhóm carbonyl, nhóm OH phenol. Có 49 chất thuộc nhóm flavonoid đã được chứng minh có tác dụng bảo vệ gan [15, 29, 38, 40, 44, 65..].
Kết quả thử nghiệm trên 2 mô hình viêm gan cấp và mạn tính của đề tài này một lần nữa góp phần khẳng định các nhận xét trên là đúng. Chế phẩm flavonoid chiết xuất từ lá ban tròn với liều thử rất thấp (0,125 - 0,250g/kg) cũng như các chất astilbin và quercitrin (0,02g/kg) chiết tách từ hỗn hợp flavonoid toàn phần đã có tác dụng bảo vệ gan (bảng 3.1) và ức chế xơ gan khá tốt (bảng 3.8). Đây thực sự là chế phẩm có triển vọng làm thuốc điều trị viêm gan mạn do virút VGB. Các chế phẩm được xếp thứ tự theo tác dụng ức chế xơ gan: Flavonoid > Cao nước lá muồng trâu > Bài thuốc số 2.
Quan sát tổ chức tế bào gan đại thể và cấu trúc vi thể gan chuột bị gây xơ gan bằng CCl4 và được điều trị bằng chế phẩm flavonoid ban tròn đã khảng định thêm nhận xét trên. Chế phẩm flavonoid ban tròn đã thể hiện tác dụng bảo vệ gan, tuy không giúp hồi phục hoàn toàn nhưng đã cải thiện các tổn thương gan rõ rệt. Đặc biệt đã hạn chế mức độ xơ hoá gan rất nhiều so với lô chuột bệnh lý không được điều trị [hình 3.7-3.14]. Đây là kết quả mới đáng ghi nhận đối với flavonoid chiết xuất từ lá cây ban tròn.
4.3- Tác dụng chống oxy hoá:
Cơ chế gây tổn thương tế bào gan của các chất độc nêu trên là khi vào gan chúng sinh ra các gốc tự do trong qúa trình chuyển hoá của chúng, dẫn đến sự gia tăng quá trình peroxy hoá lipid, phá vỡ màng tế bào, gây viêm và hoại tử gan. Nếu các gốc tự do sinh ra ngày càng nhiều thì các chất chống oxy hoá cũng mất đi càng nhiều và các sản phẩm độc hại như malonyl dialdehyd (MDA) tạo ra càng tăng lên. Vì vậy tác dụng chống oxy hoá được coi là một trong các cơ chế tác dụng bảo vệ gan của các thuốc điều trị viêm gan.
Phương pháp đơn giản để đánh giá tác dụng chống oxy hoá của thuốc là xác định hàm
lượng sản phẩm sinh ra trong quá trình peroxy hoá lipid là MDA. Thuốc được cho là có tác dụng chống oxy hoá nếu trên thực nghiệm in vivo thuốc có tác dụng giảm hàm lượng MDA trong gan chuột bị gây tăng peroxy hoá lipid bằng tác nhân độc hại.
Trong nghiên cứu này, hàm lượng MDA trong gan chuột bị gây tăng peroxy hoá lipid bằng CCl4 đã được đánh giá và so sánh giữa các lô chuột uống 3 chế phẩm cao nước lá muồng trâu, bài thuốc số 2 và flavonoid lá ban tròn (bảng 3.10). Kết quả cho thấy cả 3 chế phẩm đều làm giảm hàm lượng MDA, trong đó flavonoid liều 125mg/kg thể trọng chuột làm giảm MDA nhiều nhất (21,38%), cao nước lá muồng trâu giảm ít nhất (9,30%), bài thuốc số 2 giảm trung bình 13,46% hàm lượng MDA. Như vậy cả 3 chế phẩm đều có tác dụng chống oxy hoá thể hiện qua việc ức chế quá trình peroxy hoá lipid màng tế bào.
Các chế phẩm được xếp thứ tự theo tác dụng: Flavonoid > Bài thuốc số 2 > Cao nước lá muồng trâu.
4.4- Tác dụng hỗ trợ điều trị viêm gan mạn:
-Tác dụng chống viêm mạn:
Khi gan bị nhiễm độc thường có quá trình viêm. Phản ứng viêm phát triển thành 2 giai đoạn: cấp và mạn tính. Giai đoạn viêm mạn dẫn đến sự tăng sinh nguyên bào sợi và hình thành các mô tạo keo. Đây là mầm mống đầu tiên của quá trình xơ hoá gan. Vì vậy tác dụng chống viêm mạn cũng là một trong các cơ chế bảo vệ gan của thuốc. Các kết quả nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn của 3 chế phẩm cao nước lá muồng trâu, bài thuốc số 2 và flavonoid đều có tác dụng chống viêm mạn khá tốt, làm giảm từ 23,5 đến 26,6%
trọng lượng trung bình của ổ viêm bị gây tăng bởi amian (bảng 3.10). Tác dụng của 3 chế phẩm gần như nhau: Muồng trâu ~ Bài thuốc số 2 = Flavonoid.
-Tác dụng lợi mật:
Tác dụng lợi mật là một trong các cơ chế bảo vệ gan của thuốc vì khi thuốc gây tăng tiết mật sẽ giúp đào thải nhanh hơn các độc tố ra ngoài. Vì vậy tác dụng lợi mật của 3 chế
tốt, làm tăng từ 21,76 đến 39,64% lưu lượng mật so với chứng. Các chế phẩm được xếp thứ tự theo tác dụng: Cao nước lá muồng trâu (tăng 39, 64%) > flavonoid (29,29%) >
bài thuốc số 2 (tăng 21,76%) (bảng 3.11).
Tổng hợp các kết quả nghiên cứu ở bảng 3.12 cho thấy cả 3 chế phẩm đều có tác dụng bảo vệ gan theo cơ chế chống oxy hoá, lợi mật và chống viêm mạn nhưng chỉ có 2 chế phẩm là flavonoid và cao nước lá muồng trâu là có tác dụng ức chế xơ hoá gan - một biến chứng nguy hiểm của viêm gan mạn do siêu vi B. Các chế phẩm được xếp thứ tự theo tác dụng: Flavonoid > cao nước lá muồng trâu > bài thuốc số 2.
4.5- Tổng hợp kết quả nghiên cứu tác dụng dược lý của chế phẩm flavonoid ban tròn (bột Hypatin):
-Tác dụng bảo vệ gan:
Với liều thử 250mg/kg thể trọng chuột nhắt trắng, bột Hypatin đã làm giảm có ý nghĩa thống kê 36,50% hoạt độ của enzym GPT và 53,58% hàm lượng bilirubin trong huyết thanh chuột bị gây tăng bởi CCl4 .
-Tác dụng ức chế xơ gan:
Bột Hypatin với các liều thử 125mg/kg và 250mg/kg làm giảm hàm lượng colagen trong gan chuột cống trắng bị gây viêm gan mạn và gây tăng colagen bằng CCl4: 10,76%
(P<0.05) và 15,24% (P<0,001) tương ứng.
-Tác dụng chống oxy hoá:
Bột Hypatin với các liều thử 125mg/kg và 250mg/kg làm giảm hàm lượng MDA trong gan chuột cống trắng bị gây tăng peroxy hoá lipid bằng CCl4: 21,38% và 13,65%
tương ứng.
-Tác dụng trên tổ chức tế bào gan:
Bột Hypatin đã thể hiện tác dụng bảo vệ gan trên chuột cống trăng bi gây xơ gan bằng CCl4, tuy không giúp hồi phục hoàn toàn nhưng đã cải thiện rõ rệt các tổn thương gan. Đặc biệt đã hạn chế mức độ xơ hoá gan rất nhiều so với lô chuột bệnh lý không được
điều trị. Đây là kết quả mới đáng ghi nhận đối với cây ban tròn và chế phẩm flavonoid toàn phần.
-Tác dụng chống viêm mạn:
Bột Hypatin với liều thử 250mg/kg đã làm giảm có ý nghĩa thống kê 23,5% trọng lượng ổ viêm do amian gây ra trên chuột cống trắng.
-Tác dụng lợi mật:
Bột Hypatin với liều thử 250mg/kg đã làm tăng tiết mật 29,29% (P<0,05) so với lô chứng trên chuột nhắt trắng trưởng thành (mô hình Rudi).
Với các tác dụng dược lý thử trên chuột bị gây viêm gan cấp và mạn tính bằng CCl4
đã liệt kê ở trên, chế phẩm flavonoid ban tròn đáp các yêu cầu đối với một thuốc điều trị viêm gan mạn do virút VGB. Vì vậy flavonoid được chọn để tiếp tục nghiên cứu trên độc tính cấp và độc tính bán trường diễn.
4.6- Kết quả nghiên cứu độc tính của flavonoid:
Flavonoid chiết xuất từ lá ban tròn là một sản phẩm mới, vì vậy cần đánh giá độ an toàn trước khi đưa vào sử dụng trên lâm sàng.
*Độc tính cấp: Kết quả thử độc tinh cấp cho thấy liều không có chuột chết LD0 = 5000mg bột flavonoid, gấp 40 lần liều có tác dụng (125mg/kg). Điều này chứng tỏ bột Flavonoid có độ an toàn cao khi sử dụng.
*Độc tính bán trường diễn: Cho thỏ uống flavonoid với liều 5000mg/kg thể trọng thỏ trong 30 ngày liên tục đã không gây ảnh hưởng đến chức năng gan; thận và chức năng tạo máu của thỏ thí nghiệm (bảng 3.15 và 3.16). Kết quả nghiên cứu mô học gan thận cho thấy hình ảnh tế bào gan và thận của thỏ không bị tổn thương sau khi uống flavonoid 5000mg/kg x 30 ngày, không thấy sự khác biệt khi so sánh với hình ảnh tế bào gan và thận của thỏ lô đối chứng (hình 3.15-3.24) . Như vậy có thể kết luận chế phẩm flavonoid ban tròn không gây độc đối với cấu trúc tế bào gan và thận.