3. NỘI DUNG – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5. Phương pháp nghiên cứu
* Các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật thường qui
* Kiểm tra khuẩn lạc
Dựng que cấy bạch kim ria cấy trờn ủĩa thạch mỏu hoặc thạch huyết thanh.
Mục ủớch là kiểm tra kớch thước, hỡnh thỏi khuẩn lạc. Khuẩn lạc của Salmonella cholerae suis màu trắng, trũn ủều, búng lỏng, ủường kớnh 1-
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 43 1,5mm
*Nhuộm và soi kính: sử dụng phương pháp nhuộm Gram Chuẩn bị thuốc nhuộm:
- Dung dịch tím Genxian trong axit phenic:
Tím Genxian : 1 g Cồn 960 : 10 ml Axit phenic kết tinh : 5 g
Nước cất : 100ml
- Dung dịch Fuscin trong axit phenic:
Fuscin kiềm : 1 g Cồn 960 : 10 ml Axit phenic kết tinh : 5 g
Nước cất : 100ml
- Dung dịch Lugol
Iodua kali : 1 g Iodua tinh thể : 0,5 g Nước cất : 150ml - Cồn Axeton
Cồn nguyên chất : 5 phần Axeton : 1 phần Cách nhuộm:
o Nhỏ dung dịch tím genxian lên tiêu bản: 1 – 2 phút.
o Rửa nước nhanh, vẩy khô.
o Nhỏ dung dịch Lugol: ủể 1 phỳt.
o Rửa nước nhanh, vẩy khô.
o Nhỏ cồn Axeton.
o Rửa nước thật nhanh.
o Nhỏ dung dịch fuscin loóng : ủể 1 phỳt o Rửa nước.
o Thấm khô, sấy khô.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 44 Xem kính:
Nhuộm Gram ủể xem hỡnh thỏi, màu sắc, kớch thước vi khuẩn.
Salmonella cholerae suis.
* ðếm số vi khuẩn (ðếm số vi khuẩn trờn ủĩa thạch): Pha loóng canh trùng theo hệ số pha loãng là 10-1, 10-2, 10-3….10-7 (mỗi ống chứa 4,5 ml nước thịt và 0,5 ml canh trựng ở cỏc nồng ủộ).
Lấy ống hỳt vụ trựng, hỳt 0,1ml ở nồng ủộ pha loóng 10-7 nhỏ vào ủĩa thạch Petri ủó chuẩn bị sẵn (thạch mỏu), cấy trờn 5 ủĩa thạch, dựng ủũa thủy tinh vụ trựng dàn mỏng ủều trờn ủĩa thạch, hoặc nghiờng ủi nghiờng lại ủể 0,1 ml canh trựng ủược dàn ủều trờn mặt thạch.
Cấy xong ủỏnh dấu từng ủĩa thạch (ủộ pha loóng, lụ thớ nghiệm…) và ủể ngửa trong phũng ấm 370C/24h.
Sau 24 giờ ủem ra ủếm số khuẩn lạc mọc trờn mặt thạch. ðếm tổng số khuẩn lạc trờn 5 ủĩa thạch rồi lấy số trung bỡnh. Nhõn số trung bỡnh với 10 ủể tìm số lượng khuẩn lạc có trong 1 ml canh trùng và cuối cùng nhân với hệ số pha loãng của canh trùng [18].
Công thức tính như sau:
Trong ủú: A là số khuẩn lạc trung bỡnh trong 1 ml canh trựng.
N là hệ số pha loãng của canh trùng
* Kiểm tra thuần khiết và vô trùng
Áp dụng theo Quy trình kỹ thuật kiểm nghiệm vacxin dùng trong thú y của Cục thú y (1994), [3].
Số vi khuẩn trong
1 ml canh trùng = A x N
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 45 Bước1. Mỗi lụ vacxin ủược kiểm tra trờn cỏc mụi trường với số lượng như sau:
- 2 ống (hoặc lọ 50ml) nước thịt dinh dưỡng.
- 2 ống (hoặc ủĩa) thạch mỏu.
- 2 ống môi trường yếm khí.
- 2 ống môi trường thạch nấm.
Bước2. Cỏc mụi trường trờn ủược chế theo qui trỡnh thụng dụng hoặc từ mụi trường chế sẵn, ủể phỏt hiện ủược cỏc vi khuẩn dung huyết, hiếu khớ, yếm khí và nấm nếu có trong vacxin.
Bước3. Lượng vacxin cấy kiểm tra bằng 1-2% dung tích môi trường.
Bước4. Mụi trường ủó cấy kiểm tra ủược theo dừi 7 ngày ở nhiệt ủộ 370C.
Riờng mụi trường nấm ủể ở nhiệt ủộ phũng (25-300C).
Bước5. Vỡ ủõy là vacxin vụ hoạt (cú dựng chất diệt trựng) nờn ủể mẫu ở nhiệt ủộ 25-300C trước khi kiểm tra 24-72 giờ.
+ Vacxin ủược kiểm tra trờn mụi trường nước thịt theo 2 bước:
o Bước 1: Cấy mẫu vào 2 lọ nước thịt 50ml, theo dõi ở 370C/3ngày.
o Bước 2: Cấy chuyển từ 2 lọ nước thịt trên sang 2 ống nước thịt, theo dõi ở 370C/7 ngày.
ðọc kết quả:
Lụ vacxin ủược xem là ủạt thuần khiết khi khụng cú bất cứ loại vi sinh vật tạp nào mọc trên các môi trường trong thời gian theo dõi.
Lụ vacxin ủược xem là ủạt vụ trựng khi khụng cú bất cứ loại vi sinh vật nào (kể cả vi khuẩn nuôi cấy) mọc trên các môi trường trong thời gian theo dõi.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 46 Nuôi cấy vi khuẩn bằng công nghệ lên men tiên tiến trong sản xuất vacxin
Hiện nay cụng nghệ lờn men ủược ỏp dụng phổ biến trờn thế giới trong việc sản xuất vacxin. Công nghệ lên men thực chất là áp dụng các tiến bộ khoa học như cụng nghệ chế tạo mỏy, ủiện tử tin học, cụng nghệ vi sinh vật,…với mục ủớch cung cấp ủầy ủủ cỏc ủiều kiện tối ưu cho vi sinh vật phỏt triển như vũng khuấy, oxy, nhiệt ủộ,…
Trờn thực tế, cụng nghệ lờn men cú thể ỏp dụng ủược vào nuụi cấy virus và vi khuẩn.
Với virus, người ta ứng dụng công nghệ lên men vào sản xuất môi trường tế bào phục vụ quá trình nuôi cấy virus. Khi chế tạo môi trường tề bào, người ta chủ ủộng ủưa vào ủú những “viờn bi” cú cấu tạo ủặc biệt giỳp chỳng lơ lửng trong mụi trường, tạo ủiều kiện làm tăng bề mặt tiếp xỳc của tế bào cần nuụi với mụi trường nuụi cấy, qua ủú làm tăng số lượng tế bào cần nuụi. Cỏc tế bào ủú sẽ bỏm vào cỏc
“viờn bi” nhờ ủú làm tăng bề mặt tiếp xỳc giữa virus và cỏc tế bào nuụi. Số lượng tế bào tăng lờn thỡ virus cũng tăng theo do ủú hiệu suất nuụi cấy cũng tăng.
Với vi khuẩn, công nghệ lên men sẽ giúp tối ưu hóa các chỉ tiêu phục vụ nuụi cấy vi khuẩn như: nồng ủộ Oxy, pH, nhiệt ủộ,…qua ủú vi khuẩn luụn cú ủiều kiện tốt nhất ủể tiếp xỳc với dưỡng chất và dưỡng khớ trong ủiều kiện pH tối ưu do vậy nõng cao ủược hiệu quả nuụi cấy cụ thể là làm tăng ủược mật ủộ vi khuẩn, giảm thời gian nuụi cấy,...
*Ưu ủiểm khi ỏp dụng sản xuất vacxin phú thương hàn lợn bằng cụng nghệ lên men sục khí.
- Rỳt ngắn ủược thời gian nuụi cấy.
- ðiều khiển bằng mỏy vi tớnh nờn ủộ chớnh xỏc cao.
- Chất lượng vacxin tăng cao (do ủậm ủộ khỏng nguyờn lớn >20 tỷ/1ml, giảm khối lượng ủưa vào và số lần tiờm).