Bằng công nghệ lên men sục khí và kinh nghiệm sản xuất vacxin tại Xí nghiệp thuốc thỳ y TW, chỳng tụi ủó tiến hành sản xuất ủược 5 lụ vacxin Phú thương hàn lợn với ký hiệu là Sal1, Sal2, Sal3, Sal4, Sal5.
Quá trình sản xuất vacxin Phó thương hàn lợn vô hoạt bằng công nghệ lên men sục khí phải trải qua các khâu:
a. Sản xuất giống
b. Diệt trùng bằng focmol c. Lắc giải ủộc tố
d. Pha loãng và hấp phụ keo phèn e. Ra chai
Ở mỗi khõu sản xuất ủều yờu cầu tiờu chuẩn kĩ thuật chặt chẽ từ nguyờn liệu môi trường, thao tác kĩ thuật…Chỉ cần một khâu bị sai sót có thể làm ảnh hưởng ủến toàn bộ quỏ trỡnh sản xuất vacxin gõy nhiều thiệt hại về kinh tế cũng như cụng lao ủộng. Vỡ vậy, ở mỗi khõu chỳng tụi ủều tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu kĩ thuật một cách chặt chẽ. Các chỉ tiêu kiểm tra bao gồm: nhuộm (gram) soi và ria cấy trờn thạch ủĩa kiểm tra hỡnh thỏi của vi khuẩn cũng như khuẩn lạc. Bờn cạnh ủú là kiểm tra thuần khiết và ủếm số canh trựng nuụi cấy ủể biết ủược ủộ thuần khiết cũng như sự biến ủổi về mật ủộ của vi khuẩn trong môi trường sản xuất.
Kết quả như sau:
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 48 Hình 4.1. Tóm tắt qui trình sản xuất vacxin PTH lợn bằng công nghệ
lên men sục khí
Giống gốc vacxin PTH lợn
Kiểm tra chất lượng giống gốc
Nhân giống Cấy vào nồi lên men
Xử lý bằng formol 36%
(Tỷ lệ bổ sung 0,8%)
Lắc giải ủộc
Giai ủoạn hấp phụ keo phốn (Tỷ lệ bổ sung 10%)
Kiểm tra bán thành phẩm
Kiểm nghiệm vacxin
- Phiết kính nhuộm soi:
kiểm tra hình thái, tính chất bắt màu và sự sắp xếp trong vi trường.
- Ria cấy
- KT thuần khiết - ðếm số lượng VK
Kiểm tra vô trùng
Kiểm tra an toàn ủộc tố
KT thuần khiết giống trong MT tăng sinh ủể nhõn giống
KT vô trùng KT vô trùng KT an toàn KT hiệu lực
Nhập kho bảo quản Nhiệt ủộ 2 – 80C
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 49 4.1.1. Nhân giống sản xuất
Giống gốc ủược nhận từ Ban giống của Xớ nghiệp thuốc thỳ y, ủú là 2 chủng Salmonella cholerae suis S1 và S2. Hai chủng này luụn ủảm bảo tớnh ổn ủịnh và tớnh khỏng nguyờn cao ủó ủược Cục thỳ y cấp phộp ủể sản xuất vacxin.
Giống gốc sau khi nhận về ủược nhuộm Gram và soi kớnh ủể xem hỡnh thỏi vi khuẩn, ria cấy trờn thạch ủĩa ủể xem khuẩn lạc và ủược nuụi cấy trờn mụi trường tăng sinh (6 bỡnh tam giỏc, mỗi bỡnh cú dung tớch 600ml) ủể nhõn giống sản xuất và ủược nuụi dưỡng ở ủiều kiện 370C/ 6 giờ.
Sau ủú tiến hành kiểm tra thuần khiết trờn 4 mụi trường cơ bản là 2 ống thạch máu, 2 ống thạch thường, 2 ống nước thịt, 2 ống yếm khí. Các môi trường kiểm tra này ủược ủưa vào tủ ấm 370C và ủọc kết quả sau 24–48 giờ.
Kiểm tra thuần khiết theo tiêu chuẩn TCN 161-92 của Cục Thú y. ðộ thuần khiết ủược xỏc ủịnh bằng việc kiểm tra nhiễm tạp khuẩn. Kết quả thuần khiết như sau:
Bảng 4.1. Kết quả kiểm tra thuần khiết của 5 lô giống sản xuất vacxin (Theo 10 TCN 161-92 của Cục Thú y),[3].
Môi trường kiểm tra Lô vacxin
Thạch
máu Thạch
thường Nước thịt
ống Yếm khí Thạch nấm
Sal 1 TK TK TK - -
Sal 2 TK TK TK - -
Sal 3 TK TK TK - -
Sal 4 TK TK TK - -
Sal 5 TK TK TK - -
Ghi chú: TK = thuần khiết; - = vi khuẩn không mọc
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 50 Như vậy cả 5 lụ giống ủều ủạt tiờu chuẩn về thuần khiết. Chỳng tụi tiến hành tập trung các bình tam giác có chứa giống thuần khiết vào các bình thủy tinh 10 lớt ủể cú 1,2–1,5 lớt giống/ bỡnh. Sau ủú tiến hành lấy mẫu ủể ủếm số vi khuẩn và chuyển bỡnh giống vào tủ lạnh dương 2–40C ủể bảo quản giống (giống không sử dụng phải diệt trùng bằng Focmol, không nên sử dụng những bỡnh giống ủó ủể quỏ 7 ngày.)
4.1.2. Kết quả ủếm số canh trựng giống
Song song với việc kiểm tra thuần khiết chỳng tụi cũng tiến hành ủếm số vi khuẩn cho từng lụ vacxin. Tiến hành ủếm số ủể xỏc ủịnh ủược mật ủộ vi khuẩn trong canh trùng
Bảng 4.2. Kết quả ủếm số vi khuẩn của 5 lụ giống sản xuất vacxin (ðếm số trờn ủĩa thạch mỏu Petri, ủọc kết quả sau 24h, ủộ pha loóng 10-7)
Số khuẩn lạc MT
kiểm tra
Lô vacxin ðĩa 1 ðĩa 2 ðĩa 3 ðĩa 4 ðĩa 5
Trung bình (khuẩn
lạc)
Số lượng VK/ml
giống (tỷ/ml)
Sal1 101 104 105 99 103 102.4 10.24
Sal 2 109 105 100 101 107 104.4 10.44
Sal 3 101 106 103 98 104 102.4 10.24
Sal 4 100 102 103 107 106 103.6 10.36 Sal 5 108 101 103 104 101 103.4 10.34
Trung bình 103.24 10.32
Kết quả này cho thấy giống ủưa vào sản xuất cú số lượng vi khuẩn trung bình là 10,32 tỷ VK/ml. Lô giống có số lượng vi khuẩn lớn nhất là lô 2- Sal 2 có 10,44 tỷ VK/ml, trong khi lô thấp nhất là lô 1-Sal 1 và lô 3 – Sal 3 có 10,24 tỷ VK/ml. Theo quy ủịnh của ủơn vị sản xuất thỡ cỏc lụ giống này ủều
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 51 ủảm bảo ủủ mật ủộ vi khuẩn ủể ủưa vào sản xuất vacxin.
Như vậy, qua cỏc kết quả trờn chỳng tụi nhận thấy cả 5 lụ giống ủều ủạt cỏc tiờu chuẩn vi sinh vật ủú là: hỡnh thỏi khuẩn lạc, kớch thước vi khuẩn ủặc trưng, kiểm tra thuần khiết ủạt tiờu chuẩn TCN 161-92 của Cục Thỳ y và ủếm số vi khuẩn lớn hơn 10 tỷ VK/ml. Do ủú chỳng tụi quyết ủịnh ủưa cỏc lụ giống này vào sản xuất.
4.1.3. Kết quả kiểm tra thuần khiết canh trựng ủưa vào sản xuất vacxin Sau khi cú canh trựng ủủ mật ủộ vi khuẩn ủể ủưa vào sản xuất chỳng tụi tiếp tục tiến hành kiểm tra thuần khiết canh trựng ủưa vào sản xuất vacxin
Bảng 4.3. Kết quả kiểm tra thuần khiết canh trựng ủưa vào sản xuất vacxin
Môi trường kiểm tra
Lô vacxin TM TT NT ống YK Ghi chú
Sal1 TK TK TK - ðạt
Sal2 TK TK TK - ðạt
Sal3 TK TK TK - ðạt
Sal4 TK TK TK - ðạt
Sal5 TK TK TK - ðạt
Ghi chú: TK = thuần khiết; - = vi khuẩn không mọc
Kết luận: Canh trựng ủưa vào sản xuất của cả 5 lụ hoàn toàn thuần khiết, khụng bị tạp trựng, ủủ tiờu chuẩn kỹ thuật.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 52 4.1.4. Kết quả ủếm số canh trựng ủưa vào sản xuất vacxin
Bảng 4.4. Kết quả ủếm số vi khuẩn trong canh trựng ủưa vào sản xuất vacxin
Số khuẩn lạc
Lô vacxin ðĩa 1 ðĩa 2 ðĩa 3
Trung bình ( khuẩn
lạc)
Kết quả (tỷ VK/ml)
Sal1 220 222 221 221 22,1
Sal2 212 216 217 215 21,5
Sal3 217 218 222 219 21,9
Sal4 220 218 222 220 22
Sal5 207 211 212 210 21
Trung bình 217 21,7
Như vậy, kết quả ủếm số của cả 5 lụ trung bỡnh là 21,7 tỷ VK/ml. Trước ủõy, vacxin phú thương hàn lợn sản xuất bằng phương phỏp nuụi cấy tĩnh thỡ kết quả ủếm số vi khuẩn ủược rất ớt (250.000.000 VK/ml). Theo cụng nghệ lên men sục khí làm cho số lượng vi khuẩn tăng lên rất nhiều. Kết quả cho thấy, trong 5 lụ vacxin Phú thương hàn lợn sản xuất thỡ vi khuẩn nhõn lờn ủạt số lượng cao nhất ở lô Sal1 22,1 tỷ vi khuẩn/1ml canh trùng thu hoạch; thấp nhất là ở lô Sal5 là 21 tỷ vi khuẩn/1ml canh trùng thu hoạch. Có thể nói sự biến ủộng về số lượng vi khuẩn trong mỗi lụ sản xuất ở thời ủiểm này cú sự khỏc nhau, hay núi cỏch khỏc sự chờnh lệch so với trị số trung bỡnh tương ủối biến ủộng Cụ thể số lượng vi khuẩn ở lụ Sal1 so với giỏ trị trung bỡnh chờnh lệch 0,4 tỷ/ml canh trùng, gần với mức giá trị trung bình nhất là 2 lô Sal2 và Sal3 chờnh lệch 0,02 tỷ/ml canh trựng. Sự biến ủộng này cũn phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong ủú cú yếu tố mụi trường sản xuất cũng như mụi trường
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 53 dựng trong ủếm số vi khuẩn. Ở mỗi lụ thỡ chất lượng nguyờn liệu chế tạo ra mụi trường cũng khỏc nhau, cũng cú thể ủó phần nào ảnh hưởng ủến sự biến ủộng ủú.
Nói tóm lại, sau toàn bộ quá trình nuôi cấy sản xuất và kết hợp với phương pháp kiểm tra vi sinh vật thường qui, kết quả cho thấy các lô sản xuất vacxin Phú thương hàn ủều ủạt tiờu chuẩn thuần khiết, nhuộm gram và soi khuẩn lạc ủều cho kết quả ủồng nhất từ khõu giống ủến kết thỳc quỏ trỡnh nhõn, mật ủộ vi khuẩn ủạt trờn mức cho phộp khi ủếm số.
4.1.5. Kết quả kiểm tra vụ trựng canh trựng ủưa vào sản xuất vacxin
Sau khi có canh trùng thuần khiết chúng tôi tiến hành vô hoạt canh trùng bằng focmol 0,8%. ðể quỏ trỡnh vụ hoạt canh trựng giống ủược triệt ủể thỡ kết hợp với cho formol, canh trựng giống phải ủược lắc ủều. Sau 24 giờ tớnh từ khi cho formol tiến hành lấy mẫu kiểm tra vụ trựng. Mục ủớch của kiểm tra vụ trựng trong giai ủoạn này là ủể ủảm bảo vi khuẩn vacxin ủược vụ hoạt một cỏch triệt ủể.Chỳng tụi kiểm tra vụ trựng canh trựng
Tiến hành lấy mẫu cấy trên các môi trường: 2 ống thạch máu, 2 ống yếm khí và 1 lọ nước thịt dinh dưỡng (theo qui trình kiểm tra TCN 161 – 92 của Cục thỳ y). Kết quả ủược trỡnh bày qua bảng dưới ủõy:
Bảng 4.5. Kết quả kiểm tra vụ trựng canh trựng ủưa vào sản xuất vacxin Môi trường kiểm tra
Lô vacxin TM TT NT ống YK Ghi chú
Sal1 - - - - ðạt
Sal2 - - - - ðạt
Sal3 - - - - ðạt
Sal4 - - - - ðạt
Sal5 - - - - ðạt
Ghi chú: - = vi khuẩn không mọc
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 54 Như vậy canh trựng ủó ủược diệt trựng hoàn toàn tức là khụng cú vi khuẩn nào mọc
Cú thể núi rằng, bước kiểm tra vụ trựng ủối với canh trựng vacxin ủó ủược hoàn tất.
4.1.6. Kết quả kiểm tra an toàn ủộc tố canh trựng
Salmonella cú cả 2 loại ủộc tố: nội ủộc tố và ngoại ủộc tố. ðể biến ủổi ủộc tố thành giải ủộc tố và chế làm vacxin chỳng tụi tiến hành lắc giải ủộc ở 370C/ 7 ngày (120- 150 vũng/phỳt). Như vậy, khõu lắc giải ủộc cú ý nghĩa lớn và rất quan trọng khi sản xuất vacxin. Nếu quỏ trỡnh biến ủộc tố thành giải ủộc tố không hoàn toàn thì khi tiêm sẽ gây phản ứng bất lợi cho con vật và gây chết.
Việc kiểm tra an toàn ủộc tố của canh trựng ủược tiến hành trờn chuột bạch. Canh trựng vacxin sau khi ủược lắc giải ủộc tố thỡ tiến hành kiểm tra ủộc tố của canh trựng theo trỡnh tự như sau:
Tiến hành:
o Lấy 0,1 ml canh trùng gốc tiêm cho 10 chuột bạch.
o Vị trí tiêm: phúc xoang hay tĩnh mạch.
o Sau 7–10 ngày cả 10 chuột phải sống khỏe mạnh.
o Như thế canh trựng ủược coi là ủó ủược giải ủộc tố và chuyển sang khâu tiếp theo.
Bảng 4.6. Kết quả kiểm tra an toàn ủộc tố canh trựng sau 7 ngày lắc giải ủộc (tiờm trờn chuột bạch)
Lô vacxin
Liều tiêm (ml/con)
Số chuột
tiêm(con) Vị trí tiêm Tỷ lệ chết/sống
Tỷ lệ Sống (%)
Sal 1 0,1 10 Phúc xoang 0/10 100
Sal 2 0,1 10 Phúc xoang 0/10 100
Sal 3 0,1 10 Tĩnh mạch 0/10 100
Sal 4 0,1 10 Tĩnh mạch 0/10 100
Sal 5 0,1 10 Tĩnh mạch 0/10 100
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 55 Kết quả trờn cho ta thấy, sau khi canh trựng ủược vụ hoạt bằng focmol với tỷ lệ 0,8%, lắc giải ủộc 7 ngày ở nhiệt ủộ 370C và tiờm vào tĩnh mạch hoặc phỳc xoang cho 10 chuột bạch khoẻ mạnh (mỗi lô canh trùng tiêm cho 10 chuột). Sau 7- 10 ngày tất cả số chuột ủược tiờm ủều sống khoẻ mạnh (ủạt 100%).
Túm lại: Canh trựng ủưa vào sản xuất ủạt tiờu chuẩn an toàn ủộc tố. Tức là canh trựng sau khi ủược diệt trựng bằng focmol ở ủiều kiện nhiệt ủộ 370C thỡ ủộc tố của canh trựng hoàn toàn ủó trở thành giải ủộc tố. Như vậy, 5 lụ canh trựng vacxin ủó ủược giải ủộc triệt ủể và cú thể ủưa vào sản xuất vacxin.
Kết luận chung : Canh trựng ủưa vào sản xuất vacxin ủạt cỏc chỉ tiờu kỹ thuật là : thuần khiết sau ủú là vụ trựng; an toàn ủộc tố. Như vậy, canh trựng cú thể ủưa sang khõu sản xuất tiếp theo.
4.1.7. Kết quả kiểm tra vô trùng bán thành phẩm
Sau khi lắc giải ủộc chỳng tụi tiến hành pha loóng bằng nước muối sinh lý và bổ sung chất bổ trợ là nước phèn chua với tỷ lệ là 10%. Tác dụng của phèn chua khi cho vào vacxin có vai trò là hấp phụ xác vi khuẩn lên bề mặt, qua ủú làm hạn chế shock khi tiờm vacxin vào cơ thể con vật. Khi tiờm, phốn chua có trong vacxin sẽ gây nên phản ứng viêm nhẹ tại chỗ tiêm (phản ứng viờm này mất ủi sau 2 -3 ngày) khụng gõy hại cho con vật mà ngược lại nú giỳp cho quỏ trỡnh ủỏp ứng miễn dịch diễn ra nhanh hơn. Hơn nữa phốn chua khi ủó hấp phụ xỏc vi khuẩn lờn bề mặt thỡ nú cũn cú tỏc dụng như một “kho khỏng nguyờn” giỳp kộo dài và ổn ủịnh miễn dịch.[20 ]
Canh trựng sau khi ủược pha loóng và bổ sung chất bổ trợ là nước phốn thỡ ủược chứa vào trong cỏc bỡnh nhựa NAGEL và ủược gọi là cỏc bỡnh bỏn thành phẩm (BTP)[20]. Sau khi có các bình bán thành phẩm, chúng tôi tiến hành kiểm tra vụ trựng cỏc bỡnh bỏn thành phẩm ủú theo tiờu chuẩn của Cục Thú y (TCN 161-92). Kết quả như sau:
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 56 Bảng4.7. Kết quả kiểm tra vô trùng bán thành phẩm
Môi trường kiểm tra Lô vacxin
TM TT NT ống YK ðánh giá
Sal1 - - - - ðạt
Sal2 - - - - ðạt
Sal3 - - - - ðạt
Sal4 - - - - ðạt
Sal5 - - - - ðạt
Ghi chú: - = vi khuẩn không mọc
Kết luận: cú ủược mẫu vacxin ủạt tiờu chuẩn. Sau ủú chỳng tụi tiến hành kiểm nghiệm tại phòng kiểm nghiệm của Xí nghiệp thuốc thú y TW.
Tóm lại, qua theo dõi quá trình sản xuất chúng tôi nhận thấy gắn với mỗi giai ủoạn sản xuất ủều ủược kiểm tra một cỏch chặt chẽ cỏc chỉ tiờu như: kiểm tra hỡnh thỏi vi khuẩn, ria cấy ủỏnh giỏ chất lượng khuẩn lạc, thuần khiết cũng như vụ trựng, ủếm số... ðõy ủều là những chỉ tiờu kiểm tra vi sinh vật thường qui, giỳp cho quỏ trỡnh sản xuất vacxin ủược khộp kớn và hoàn thiện.