Ph−ơng pháp lấy mẫu phân

3. Nội dung, nguyên liệu và ph−ơng pháp nghiên cứu

3.3. Ph−ơng pháp nghiên cứu

3.3.1. Ph−ơng pháp lấy mẫu phân

Mẫu phân đ−ợc lấy trực tiếp từ hậu môn lợn hoặc lấy ngay sau khi lợn thải ra, cho vào lọ đựng mẫu đl đ−ợc khử trùng, bảo quản trong điều kiện 4- 80C, gửi đến các phòng thí nghiệm.

3.3.2. Phương pháp điều tra tình hình hội chứng tiêu chảy ở đàn lợn ngoại h−ớng nạc tại Thanh Hoá

- Số liệu điều tra năm 2003, 2004, 2005 qua sổ theo dõi của các trại.

- Số liệu điều tra 6 tháng đầu năm 2006 theo ph−ơng pháp mô tả, quan sát trực tiếp tại chuồng nuôi.

3.3.3. Phương pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1 gram phân lợn tiêu chảy và không tiêu chảy

Trường ðại học Nông nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ------41 Theo phương pháp kiểm tra số lượng vi khuẩn bằng cách đếm số khuẩn lạc phát triển trên môi tr−ờng thạch của Nguyễn Vĩnh Ph−ớc (1976) [43].

Mẫu phân cần xác định vi khuẩn đ−ợc nghiền trong cối sứ và pha lolng với nước vô trùng ở các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3…10-10. Dùng pipet hút 0,2 ml dịch pha lolng cấy vào một đĩa thạch (mỗi nồng độ pha lolng cấy vào 2 đĩa), dùng que gạt thuỷ tinh đl vô trùng dàn đều dịch trên khắp bề mặt thạch, để các đĩa thạch đl cấy trong tủ ấm 370C, thời gian 24 giờ. Tiến hành đếm số khuẩn lạc (CFU) phát triển trên môi tr−ờng thạch bằng cách dùng bút chì viết kính, chia

đáy hộp ra thành nhiều phần, sau đó lần l−ợt đếm số l−ợng khuẩn lạc trong từng phần, từ đó tính ra số l−ợng vi sinh vật trong mỗi đơn vị thể tích nghiên cứu.

- Tính theo công thức

X = 5.a.b

Trong đó: X là tổng số vi khuẩn trong 1gram phân

a là số l−ợng CFU trung bình trên một đĩa thạch b là hệ số pha lolng

3.3.4. Phương pháp phân lập, giám định vi khuẩn E.coli và Salmonella - Víi E.coli

Mẫu phân đ−ợc cấy vào môi tr−ờng Istrati, Macconkey hoặc các môi trường đặc trưng khác của vi khuẩn đường ruột. Trên môi trường Macconkey sau nuôi cấy 18-24 giờ khuẩn lạc có màu đỏ dạng S. Trên môi trường E.M.B có khuẩn lạc màu đen tím. Trên môi trường Endo khuẩn lạc có màu đỏ…

Quy trình phân lập, giám định vi khuẩn E.coli đ−ợc mô tả ở sơ đồ 1.

- Víi Salmonella

Mẫu phân đ−ợc cấy vào môi tr−ờng Macconkey có khuẩn lạc không màu. Trên môi trường Brilliant Green có khuẩn lạc màu đỏ. Trên môi trường E.M.B có khuẩn lạc màu đỏ hồng. Trên môi trường Endo khuẩn lạc có màu vàng…

Quy trình phân lập, giám định vi khuẩn E.coli đ−ợc mô tả ở sơ đồ 2.

Trường ðại học Nông nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ------42 Sơ đồ1: phân lập và giám định vi khuẩn E.coli

(Theo Carter G.R., 1995 [84])

Pha lolng 10 x

H×nh thái (Gram)

N−íc thịt

Thạch th−êng

động

Lên men

®−êng

Kligler VP MR

HH Tóm tắt một số đặc tính sinh hoá của E.coli theo bảng sau:

Triple-Sugar-Iorl Manitol Ure-Indol Môi tr−ờng

Vi khuẩn Glucoza Lactoza H2S Gaz Di động Mannit Ure Indol Citrat

Escherichia coli + + - + + + - + -

Gia súc bình th−ờng Phân Gia súc tiêu chảy

Istrati

(khuẩn lạc thuần khiết dạng S màu vàng) E.M.B

(khuẩn lạc màu đen tím) tÝmtÝm

Đếm số khuẩn lạc Macconkey (khuẩn lạc màu đỏ)

Endo

(khuẩn lạc đỏ) Khuẩn lạc thuần

khiÕt Brilliant Green

(khuẩn lạc vàng chanh)

Tính chất sinh học

Kiểm tra hình thái, nuôi cấy Kiểm tra đặc tính sinh hoá

Định type

H2S

Trường ðại học Nông nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ------43 Sơ đồ 2: phân lập và giám định vi khuẩn Salmonella

(Theo Carter G.R., 1995 [84])

Pha lolng 10 x

H×nh thái (Gram)

N−íc

thịt Thạch

thường Di động

Lên

®−êng men Kligler VP MR

Tóm tắt một số đặc tính sinh hoá của Salmonella theo bảng sau:

Triple-Sugar-Iorl Manitol Ure-Indol Môi tr−ờng

Vi khuẩn Glucoza Lactoza H2S Gaz Di động Mannit Ure Indol Citrat

Salmonella + - + + + + - - +

Gia súc bình th−ờng Phân Gia súc tiêu

chảy Muller Kauffman, Istrati

(khuẩn lạc thuần khiết dạng S màu xanh) E.M.B

(khuẩn lạc đỏ hồng) Đếm số khuẩn lạc

Macconkey (khuẩn lạc không màu)

Môi tr−ờng SS (khuẩn lạc trắng) Endo

(khuẩn lạc vàng) Khuẩn lạc thuần

khiÕt Brilliant Green

(khuẩn lạc đỏ)

Giữ trên thạch máu

Tính chất sinh học Định type

Kiểm tra hình thái, nuôi cấy Kiểm tra đặc tính sinh hoá

H2S

Trường ðại học Nông nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ------44 3.3.5. Xác định độc lực của vi khuẩn E.coli và Salmonella phân lập

Theo ph−ơng pháp của Lindner (1986), Wilcock và Schwartz (1992)

Động vật thí nghiệm: chuột nhắt trắng khoẻ mạnh, khối l−ợng từ 18-20 gr.

Vi khuẩn phân lập, nuôi cấy trong môi tr−ờng n−ớc thịt ở 370C/24 giờ,

đậm độ vi khuẩn đạt 1010/ml. Mỗi chủng vi khuẩn E.coli hoặc Salmonella

đ−ợc tiêm cho 2 chuột, mỗi con 0,2 ml canh trùng vào xoang bụng. Sau khi tiêm theo dõi triệu chứng, số chuột chết và thời gian chết của chuột. Mổ khám bệnh tích những chuột bị chết trong thời gian theo dõi để kiểm tra bệnh tích và làm tiêu bản nhuộm gram để tìm vi khuẩn E.coli hoặc Salmonella trong chuột thí nghiệm.

3.3.6. Xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của E.coli và Salmonella phân lập được bằng phương pháp kháng sinh đồ (Theo Bauer - Kirby 1990)

Chọn những khuẩn lạc điển hình của E.coli, Salmonella nuôi cấy trên môi trường thạch thường, pha trong nước muối sinh lý để được huyễn dịch vi khuẩn có đậm độ 106 vi khuẩn/ml. Lấy 0,1 ml huyễn dịch nhỏ lên môi trường Muller-Hinton (mặt thạch dày 4mm), láng cho đều vi khuẩn trên mặt thạch.

Để khô, dùng panh đặt các khoanh giấy tẩm kháng sinh, ấn nhẹ để khoanh giấy tiếp xúc hoàn toàn với mặt thạch. Giữ yên các đĩa thạch trong nhiệt độ phòng để kháng sinh khuếch tán đều, đặt vào tủ ấm 370C/24 giờ, lấy ra đo

đường kính vòng vô khuẩn, đánh giá sự mẫn cảm của vi khuẩn, độ mẫn cảm

đ−ợc xác định theo bảng tiêu chuẩn của Bauer - Kirby.

Trường ðại học Nông nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ------45

Bảng tiêu chuẩn “ Standard Kirby – Bauer”

Vòng vô khuẩn Tên thuốc Rất mẫn cảm

(mm)

Mẫn cảm (mm)

Kháng (mm)

Ampicillin >14 12-13 <11

Neomycin >15 13-14 <12

Amoxycllin >17 12-16 <12

Enro floxacin >29 21-28 <20

Ciprofloxacin >21 13-21 <12

Kanamycin >17 15-17 <15

Gentamycine >16 14-16 <14

3.3.7. Thử nghiệm phòng bệnh bằng một số chế phẩm vi sinh - Men vi sinh dùng thử nghiệm: Microcin, Piglet-8, Nutrifarm.

- Bố trí thí nghiệm: lợn thuộc đàn thương phẩm, nuôi ở chuồng nền, thức ăn công nghiệp, cùng trang trại, cùng thời gian.

Lô thí nghiệm (TN): Sử dụng men vi sinh theo quy trình của nhà sản xuất.

Lô TN1:

- Đối t−ợng lợn 1-21 ngày tuổi

- Men microcin: cho lợn uống 3 lần vào ngày thứ 1; 2 và 3 sau khi sinh, liều 2gram/con/ngày.

- Men vi sinh Piglet-8, 100gram trộn vào 50 kg thức ăn cho lợn con tập

ăn, cho ăn liên tục đến 21 ngày tuổi.

Lô TN 2:

- Đối t−ợng lợn từ 22 - 60 ngày tuổi.

- Men Nutrifarm, 100g trộn vào 80kg thức ăn cho lợn 22 đến 60 ngày tuổi.

Lô đối chứng (ĐC): không sử dụng chế phẩm vi sinh.

Trường ðại học Nông nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ------46 Lô ĐC 1: lợn từ 1-21 ngày tuổi.

Lô ĐC 2: lợn từ 22-60 ngày tuổi.

- Theo dõi thí nghiệm: Cân trọng l−ợng lợn tr−ớc và sau thí nghiệm, theo dõi bệnh qua triệu chứng lâm sàng, số con bị tiêu chảy, số con chết, thời gian điều trị khỏi.

3.3.8. Phương pháp bố trí thí nghiệm điều trị tiêu chảy bằng các phác đồ - Phân lô thí nghiệm: Lợn bị tiêu chảy lứa tuổi 1-21 ngày đ−ợc đánh dấu từng con để tiện theo dõi và điều trị. Mỗi lô thí nghiệm một phác đồ điều trị.

- Điều trị bằng kháng sinh mẫn cảm:

Phác đồ 1: Enrofloxacine: 2ml/10kg thể trọng/ lần, tiêm bắp.