Chương 2 NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.4.Phương pháp phân lập vi khuẩn Salmonella
Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Phương pháp phát hiện Salmonella trên ựĩa thạch TCVN 4829 : 2005 (ISO 6579 : 2002).
Bước 1: Tăng sinh
Cân 25g mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 225ml dung dịch BPW và ựồng nhất bằng Stomacher trong 2 phút. Ủ ở 37o trong 18 Ờ 24 giờ.
Bước 2: Tăng sinh chọn lọc
Lắc ựể trộn ựều dịch tăng sinh và chuyển 0,1ml sang ống chứa 10ml môi trường tăng sinh Rappaport - Vassliadis Soya Pepton (RV) ựã ựược ủ ấm ựến 42oC. sau ựó ủ ở 42oC trong 18 - 24 giờ. Khi cần thiết có thể kéo dài thời gian ủ thêm 24 giờ.
Chuyển 0,1ml dịch tăng sinh thu ựược vào ống chứa 10ml Muller Kauffmann tetrathionat ủ ở 37oC trong 24 giờ.
Bước 3: Phân lập và nhận diện
Từ môi trường Rappaport - Vassliadis Soya Pepton cấy chuyển sang môi trường BGA, ủ 37oC/24 giờ. đọc kết quả: Khuẩn lạc có màu ựỏ hồng, tròn bóng, lồi trên mặt thạch.
Từ môi trường Muller Kauffmann ria cấy sang môi trường XLT4, ủ 37oC/24 giờ. đọc kết quả: Khuẩn lạc có màu ựen, tròn bóng, lồi trên mặt thạch.
Bước 4: Khẳng ựịnh
Thử nghiệm H2S: Cấy khuẩn lạc trên môi trường TSI. Salmonella chỉ lên men ựược ựường glucose trong các môi trường trên vì thế phần thạch nghiêng của môi trường có màu ựỏ, phần sâu có màu vàng. đa số các dòng
Salmonella ựều có khả năng sinh H2S nên có xuất hiện các vệt màu ựen trong môi trường này. Vi khuẩn sinh hơi làm rạn nứt thạch môi trường hoặc môi trường bị ựẩy lên tạo một khoảng không dưới ựáy ống nghiệm.
Thử nghiệm urea: Salmonella không phân giải ure nên không làm thay ựổi pH môi trường, sau khi nuôi cấy môi trường canh thang ure vẫn giữ nguyên màu vàng cam.
Thử nghiệm Indol: Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống chứa 5ml môi trường Tryptophan. Ủ ở 37oC trong 24h. Sau khi ủ nhỏ 1 giọt thuốc thử KovacỖs. Nếu xuất hiện vòng màu ựỏ - phản ứng dương tắnh. Nếu xuất hiện vòng màu nâu vàng Ờ phản ứng âm tắnh.