Chương 2 NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.2. Phương pháp thu thập mẫu
Mẫu ựược lấy ngẫu nhiên tại các quầy bán thịt tại một số chợ thuộc huyện Gia Lâm Ờ Hà Nội. Lấy mẫu theo TCVN:
Thịt và sản phẩm của thịt Ờ Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử: TCVN 4833 - 1:2002; TCVN 4833 Ờ 2 : 2002.
ựược vận chuyển về phòng thắ nghiệm.
2.3.3. Phương pháp phân lập vi khuẩn E. coli
Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Phương pháp phát hiện và ựịnh lượng Escherichia coli giả ựịnh. Kĩ thuật ựếm số có xác suất lớn nhất 6846 : 2007 (ISO 7251 : 2005).
Chuẩn bị mẫu: đối với thịt ựể ựông lạnh, phải rã ựông tự nhiên ở nhiệt ựộ phòng cho ựến khi ựạt 13-15oC. Dùng kéo và panh vô trùng cắt thịt thành những miếng nhỏ. Cân 25g thịt ựã cắt nhỏ, cho vào túi ựựng mẫu, cho vào thêm 225ml nước sinh lý. Sử dụng máy dập mẫu ựể ựồng nhất mẫu trong thời gian khoảng 2 phút (chọn tốc ựộ 230rpm). Tiếp tục pha loãng mẫu theo bậc pha loãng thập phân (10-2, 10-3, 10-4Ầ)
Cấy và ủ vào môi trường canh thang Brilliant Green : Sử dụng phương pháp 9 ống, mỗi ống có 10ml môi trường và 1 ống Durham. Chọn 3 ựộ pha loãng liên tiếp, mỗi ựộ pha loãng cấy 1ml vào 3 ống môi trường. Lắc nhẹ ống môi trường ựể ống Durham chìm xuống, không có bọt khắ trong ống Durham. đem toàn bộ 9 ống ủ ở 37oC trong 48 giờ, sau ựó lấy ra ựọc kết quả: Ống dương tắnh là những ống có sinh hơi, ống Durham nổi lên, môi trường chuyển từ màu xanh sang màu vàng nhạt.
Từ các ống dương tắnh ria cấy sang môi trường thạch ựĩa MacConkey, EMB. Ủ các ựĩa này ở 37oC/24h. Trên môi trường MacConkey: khuẩn lạc E. coli
có màu hồng cánh sen, tròn gọn; EMB: khuẩn lạc tròn, dẹt, có ánh kim tắm. Tiến hành thử nghiệm IMViC:
+ Phản ứng sinh Indole: Cấy vi khuẩn vào môi trường nước peptone. Ủ ở 37oC trong 24 Ờ 48 giờ. Nhỏ 1ml thuốc thử KovacỖs vào ống môi trường. Phản ứng (+) lớp thuốc thử trên mặt môi trường có màu ựỏ.
+ Phản ứng với ựỏ methyl (Methyl red): Cấy vi khuẩn vào môi trường nước peptone glucose. Ủ ở 37oC trong 2 Ờ 4 ngày. Nhỏ 5 giọt thuốc thử ựỏ methyl vào ống môi trường. Phản ứng (+)màu ựỏ.
+ Phản ứng Voges Proskauer: Cấy vi khuẩn vào môi trường nước peptone glucose. Ủ ở 37oC trong 48 giờ. Chuyển 1ml canh trùng sang 1 ống nghiệm khác. Nhỏ vào 0,6ml dung dịch cồn α-naptol, 0,2ml dung dịch Kalihydroxide 40%, lắc ựều. đọc kết quả sau 5 Ờ 15 phút: Phản ứng (+): màu dỏ.
+ Trên môi trường thạch Simmons Citrate: Ria cấy vi khuẩn trên mặt thạch nghiêng. Ủ ở 37oC trong 1 Ờ 3 ngày. E. coli không mọc trên môi trường
Khuẩn lạc E. coli giả ựịnh cho kết quả thử nghiệm IMViC tuần tự là + + - - chắnh là E. coli. Ghi nhận số lượng các ống nghiệm có E. coli (+) ở mỗi ựộ pha loãng của mẫu.
Ớ đọc kết quả
Xác ựịnh số ống dương tắnh ở mỗi ựộ pha loãng, từ ựó tra bảng MPN thắch hợp, tắnh kết quả theo công thức sau:
MPN/g hay MPN/ml= (MPN/g hay ml trong bảng ọ 100) x số lần pha loãng mẫu của nồng ựộ ở giữa