CHƯƠNG 2. VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Các thí nghiệm của khoá luận được bố trí theo sơ dé Hình 2.1
Ow định chuột trong phteg thí nghiệm
3 tuần
.—————————————==x
'
¡ nưứt Šsz vào lúc 7 giờ và |
17 gid hàng ngày '
-————————======-.m====-==-=-=—=—==.~===—=======—=—==-—===—=—=—=—=—==—=—===—===m===—=—====~
Thu mẫu sew 4 tuần, $ tuần
Í Chỉ (Pb?) pha trong nước, |
| se ri, vitamin C được bow: H
{theo đường thye quan H
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tông thể Mỗi nghiệm thức bố tri 12 chuột.
DC: Đối chứng, NT: Nghiệm thức.
26
2.3.1. Phương pháp chăm sóc chuột
Chuột nhắt trắng đực (Mus musculus var. albino) 4 tuần tuổi được mua từ Viện Pasteur Thanh pho Hồ Chi Minh. Chuột nuôi ôn định ở điều kiện phòng thí nghiệm trong 2 tuần cho dat trọng lượng 19 - 21 g (tương ứng 6 tuân tudi) trước khi tiến hành
thí nghiệm.
Điều kiện nuôi: chuột được nuôi trong long kính kích thước 30x19x19 cm’, dưới nên chuông lót trau, trên nắp chuồng đậy bang lưới inox (6 con/chuéng); chu ki sáng tôi (10 giờ sáng và 14 giờ toi) ở nhiệt độ phòng (27 - 28°C), có độ âm từ 76 - 80%
được ghi nhận bởi máy đo nhiệt kế điện tử đặt trong phòng. Thức ăn cho chuột là viên thức ăn tông hợp chuyên cho chuột được mua từ Viện Sinh học nhiệt đới, nước uống là gồm nước sinh hoạt của phòng thí nghiệm. Chuột được cho ăn, bô sung nước uống vào lúc 7 giờ và 17 giờ hàng ngày. Chuông nuôi được thay trau 2 - 3 ngày/lần.
2.3.2. Cơ sở chọn nông độ chì, dịch ép quả So rỉ và vitamin € thương mại Cơ sở chọn nông độ chì:
Theo Nguyễn Thị Thương Huyền (2022), nghiên cứu của đề tải cơ sở mã số CS.2019.19.29 cho thấy sự thay đối số lượng tế bào máu, cấu trúc mô gan, thận, lách
ở nông độ chì 70 mg/kg thé trọng [41]. Sử dụng kết quả trên là cơ sở chọn nồng độ chì 70 me/kg thé trọng làm nghiên cứu gây nhiễm cho hệ sinh sản chuột nhat tring đực (Mus musculus var. albino) trong 2 tuan thi nghiém.
Co sở chọn nông độ dịch ép thịt qua Sơ ri:
Theo nghiên cứu của El-Neweshy và cộng sự (2011) vitamin C nông độ 20 mg/kg thé trọng có thé cải thiện và giảm thiểu các tác động bệnh lí bat lợi của nhiễm độc chi trong 60 ngày [32]; của Autifi và cộng sự (2018) cho thấy với nồng độ vitamin
€ với liều 27 mg/ngày có thé cải thiện những thay đôi do độc tinh của chi gây ra do
đặc tính chong oxi hoá va loại bo các góc tự do của nó [37]; của Ebuehi va cộng sự
(2012) cũng đã chứng ming vitamin C nông độ 40 mg/kg thẻ trọng làm giảm dang kế nông độ chi trong máu, cai thiện tôn thương do stress oxi hoá gây ra bởi độc tính của chì [35]. Thực hiện khảo sát thử nghiệm thăm do 3 nồng độ vitamin C từ địch ép quả Sơ ri là 20. 30 và 40 mg/kg thê trọng trên chuột nhất trắng trong 2 tuần, cùng với
27
trong phạm vi nghiên cứu của dé tài này, các nồng độ dịch ép quả Sơ ri đều được chọn dé thực hiện ở thí nghiệm này. Ngoài ra, dé có cơ sở so sánh, vitamin C thương mại (30
mg/kg thê trọng) được chọn dé làm đối chứng dương cho thí nghiệm.
2.3.3. Bé trí thí nghiệm
72 chuột đạt tiêu chuân làm thí nghiệm được phân chia vào 6 nghiệm thức (I2 chuột/nghiệm thức) (Hình 2.2) và đánh dau theo thứ tự có định ở đuôi cho từng con ở từng nghiệm thức, cụ thé:
— Nghiệm thức | - Đối chứng (DC): chuột uống nước máy khử clo bình thường.
~ Nghiệm thức 2 - Đối chứng âm (Pb): chuột uống nước pha Pb từ chi nitrate
với nòng độ 70 mg/kg thé trọng.
— Nghiệm thức 3 - Đối chứng dương (VC): chuột uỗng nước pha Pb tir chì nitrate với nòng độ 70 mg/kg thẻ trọng kết hợp với vitamin C thương mại (30 mg/kg thé
trọng).
~ Nghiệm thức 4 (PbSR20): chuột uống chi với nồng độ 70 mg/kg thé trọng + lượng địch ép quả sơ ri tương đương nông độ 20 mg vitamin C/kg thê trọng, gọi tắt là nông độ 20 mg/kg thẻ trọng.
~ Nghiệm thức 5 (PbSR30): chuột uống chi với nồng độ 70 mg/kg thé trọng + lượng dich ép quả sơ ri tương đương nông độ 30 mg vitamin C/kg thê trọng. gọi tat là nồng độ 30 mg/kg thẻ trọng.
— Nghiệm thức 6 (PbSR40): chuột uống chi với nòng độ 70 mg/kg thé trọng + lượng dịch ép quả sơ ri tương đương nồng độ 40 mg vitamin C/kg thé trọng, gọi tắt là nồng độ 40 mg/kg thẻ trọng.
Đề tài được Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu trên động vật (ACUCUS) chấp thuận với mã số hồ số 1170B/KHTN-ACUCUS ngày 19 tháng 11 năm 2019 (Phụ lục 6).
EE — - eer
Hình 2.2. Bố trí chuồng nuôi chuột thí nghiệm
2.3.4. Phương pháp nghiên cứu
2.3.4.1. Phương pháp chuẩn bị dich ép qua Sơ ri, dung dich chi nitrate và
dung địch vitamin C thương mại
Qua Sơ ri được mua từ Gò Công (Tiền Giang) (Hình 2.3) được rửa sạch. tách hat lay phần thịt quả, ép lay nước. Dịch ép được gửi tới Trung tâm xét nghiệm Case đề xác định hảm lượng vitamin € (Phu lục 5). Đồng thời dùng dịch ép này đề định lượng vitamin € theo phương pháp chuẩn độ oxi hoá khử sử dụng iodine. Dựa trên kết quả phân tích hàm lượng vitamin C có trong dich ép quả Sơ ri (12 254 mg/kg thịt qua) tính toán thé tích cho chuột uống theo nồng độ khảo sát của từng nghiệm thức.
Hình 2.3. Qua Sơ ri chua Brazil được được sử dụng thu dịch ép
Pha muối chi nitrate (Pb(NOs)2) với nước cất dé thu được dung dịch chì nitrate (Pb(NOs)2) nồng độ 70 mg/kg thé trọng. Tính toán thé tích can cho từng chuột uống, dam bảo tương ứng với nông độ 70 mg/kg thê trọng.
29
Pha bột vitamin C thương mại với nước cất dé thu được dung dich vitamin C thương mại nông độ 30 mg/kg thé trọng. Tính toán thẻ tích cần cho từng chuột uống, dam bảo tương ứng với nông độ 30 mg/kg thê trọng.
2.3.4.2. Phương pháp cho chuột uống chi, vitamin C và dich ép quả Sơ rỉ
Nước nhiễm chi, nước ép Sơ ri, vitamin C thương mại được cho chuột uéng bang cách dùng xi lanh 1 mL gắn với đầu kim chuyên dụng (số 8) bom trực tiếp qua miệng xuống thực quản (Hình 2.4). Trước khi cho chuột ăn 30 phút, cho chuột uéng nước nhiễm chi, khung thời gian cho uống chì vào lúc 06 - 07 giờ sáng hàng ngày.
Thời gian cho uống dịch ép quả Sơ ri và vitamin C thương mại vào mỗi 10 giờ hàng ngày. Các chuột được theo déi và ghi nhận các dấu hiệu bất thường hằng ngày vao số
nhật kí (nếu có) trong 30 phút kế từ khi cho uống chi, dich ép Sơ ri hay dung dich
vitamin € thương mai.
Hình 2.4. Hình minh họa thao tác cho chuột uống 2.3.4.4. Phương pháp thu nhận mẫu tỉnh hoàn và tinh dich
Thu nhận ở hai đợt, sau 4 tuần và § tuần thí nghiệm; ở mỗi đợt sẽ thu nhận tinh hoàn (Hình 2.5) và tỉnh dịch của một nửa tông số chuột ở mỗi nghiệm thức. Tại mỗi mốc thời gian thu mẫu, chuột thí nghiệm được gây chết bằng cách gây mê bởi thuốc tiêm ketamin kết hợp với xylazine (liều 0,1 mL/10 g thé trọng); khử trùng vị trí mô;
mé 6 bụng chuột; kéo tỉnh hoản; mao tinh hoản ra khỏi xoang bụng; dùng kéo nhỏ mũi nhọn tách phan mỡ và thu 2 mào tinh kèm một đoạn ống dẫn tinh chuyên vào
30
eppendorf chứa 1 mL môi trường CBZ; thu nhận 02 tinh hoàn (được tách mỡ) dé xác định kích thước vả khối lượng.
Parr YSN, , có
Hình 2.5. Phương pháp thu mào tinh và mẫu tinh hoàn chuột
A. Mao tinh B. Tinh hean
Chuyên eppendorf chứa 02 mao tinh vào dia petri thủy tinh ®35 chứa 1 mL dung dich CBZ và đưa lên kính hién vi soi ndi; dùng 2 kim 1 mL xé mao tinh va day tinh dich ra môi trường CBZ (Hình 2.6); dùng pipetman 1000 mL thu nhận hết môi
trường có tinh dịch vào 1 eppendorf mới, huyền phù hỗn hợp tinh dịch [42]. Dùng mẫu tinh dich dé xác định mật độ tinh trùng và đánh gia chất lượng tỉnh trùng.
31
2.3.4.5. Phuong pháp xác định kích thước và khói lượng tinh hoàn
~ Cân khối lượng từng tinh hoàn của từng chuột thí nghiệm dé tính khối lượng
tỉnh hoàn trung bình.
~ Dùng thước kẹp đo kích thước từng tinh hoàn của từng chuột thí nghiệm dé
xác định kích thước trung bình của tỉnh hoàn. Do chiều đọc vả chiều ngang của tinh
hoàn chuột (Hình 2.7).
Hình 2.7. Phương pháp đo kích thước và khối lượng tỉnh hoàn chuột
2.3.4.6. Phương pháp đánh giá mat độ tinh trùng chuột
Mật độ tinh trùng (C) là số tỉnh trùng hiện diện xác xuất trong Í mL tỉnh dịch.
Thực hiện việc đếm tinh trùng bằng phương pháp đếm tế bao trên buồng đếm tế bao cai tiễn. Pha loãng tỉnh trùng đã được chuẩn bị ở mục 2.3.4.4 theo tỉ lệ 10 uL tỉnh dịch với dung dich pha loãng tinh trùng tương ứng, ta được lúc nay mau tinh trùng được pha
loãng 10 lần. Lay 20 pL mẫu tinh trùng vừa pha chuyển vào buông đếm (Hình 2.8).
Đếm số lượng tinh trùng trong 400 ô nhỏ tương ứng 25 ô lớn. Công thức tinh:
Trong đỏ:
+ C: Mật độ tính trong trong tinh dịch
C=Nx10°xD + Ð: Dé pha loãng tinh dich
+ N: Số tinh trùng đếm được trong 400 6 vuông nhỏ.
Hình 2.8. Mật độ tinh trùng trên buồng đếm Neubauer (x40) 2.3.4.7. Phương pháp đánh giá chất lượng tinh tring chuột
Chất lượng tinh trùng chuột được đánh giá thông qua tỉ lệ song, ti lệ tinh trùng
bình thường (hình dạng, độ di động) [42].
~ Ti lệ sống của tinh trùng được xác định bằng phương pháp nhuộm đơn với
thuốc nhuộm Eosin. Tinh trùng sông khi đầu tinh trùng không bắt mau thuốc nhuộm,
tỉnh trùng chết sẽ bắt màu hồng của thuốc nhuộm (Hình 2.9). Thực hiện đếm số tỉnh trùng chết trong tông só 200 tỉnh trùng cho một chuột thí nghiệm (lặp lại 3 lần tương ứng với 600 tinh trùng/chuột), từ kết quả này tính được tỉ lệ tinh tring sông.
~ Độ đi động của tinh trùng được xác định trực tiếp từ mau tinh dịch đã chuẩn bị ở mục 2.3.4.4 dưới kính hién vi đảo ngược thông qua phần mém Nikon kết hợp camera hỗ trợ. Tạo vi giọt tinh dịch (100 pL) dưới lớp dầu khoáng trên đĩa 4 giếng.
quan sát dưới kính hiển vi đáo ngược và quay video, đểm 100 tinh trùng di động các kiêu (tiến thăng, bơi vòng, không bơi tiễn thăng) từ đó xác định số lượng tinh trùng di động bình thường (tiến thing) ở mỗi chuột (lặp lại 03 lần tương ứng với 300 tinh trùng/chuột). Từ kết quả này sẽ quy ra được tỉ lệ đi động của tỉnh trùng.
33
— Tỉ lệ di dạng của tinh trùng được khảo sát thông qua mẫu nhuộm đơn (đánh giá
tỉ lệ sống) và video đánh giá độ đi động của tinh trùng chuột. Sau khi khảo sat sơ bộ
các mẫu ở các nghiệm thức, trong nghiên cứu nảy chọn phương pháp xác định tỉ lệ dị
dang thông qua video di động của tinh trang chuột (độ chính xác cao hơn). Dém số tinh trùng dj dang về hình thái: cỗ cong, đuôi ngắn, hai đuôi, hai đầu, có cham đốm ở phần đuôi trong tông số 100 tỉnh trùng và lặp lại 3 lần ở mỗi chuột (300 tinh trùng/chuột).
Từ đó tính tỉ lệ tinh trùng bất thường.
A BỊ
ÂẮệ =
li
Hình 2.9. Trang thai của tinh trùng sau khi nhuộm kép (x40)
A. Trạng thái tỉnh trùng sóng B. Trạng thái tình trùng chết
2.3.4.8. Phương pháp đánh giá chất lượng và quan sát vi thé của tinh hoàn
Kết thúc mỗi 4 tuần thí nghiệm, sau khi đo kích thước và xác định khôi lượng tỉnh hoàn, đem cé định trong dịch formalin 10% và gửi mẫu dé nhuộm H&E (Hình 2.10). Đánh giá mức độ ton thương qua tiêu bản cô định dưới kính hiện vi quang học
tại phòng thí nghiệm Giải phẫu - Sinh lí người và Động vật.
Hình 2.10. Hình minh hoạ mẫu ngâm tỉnh hoàn chuột nhat trắng 2.3.4.9. Phương pháp xử lí số liệu
Tất cả số liệu của đề tài được xử lí theo các thuật toán xác suất thông kê trên máy vi tính bang phần mém thống kê Graphpad Prism 9.2. Phân tích phương sai một yếu tô (One — way Anova). Các số liệu được trình bảy theo giá trị trung bình (TB), độ lệch chuẩn (Standard Deviation - SD). Mức ý nghĩa được sử dụng dé kiêm định sai khác có ý nghĩa các nghiệm thức là 0,05 (p < 0,05 thì sự sai khác có ý nghĩa thông
kê).