1.2. Tổng quan vấn đề nghiên cứu
1.2.4. Phương pháp cải tiến giống nấm
Có nhiều phương pháp cải tiến giống được sử dụng, nhưng cơ bản có thể phân thành 3 nhóm phương pháp chính: phương pháp tuyển chọn, phương pháp chuyển gen và phương pháp lai.
1.2.4.1. Phương pháp tuyển chọn
Đầu tiên, các giống nấm có những đặc điểm mong muốn sẽ được tuyển chọn từ tự nhiên hoặc từ môi trường nuôi trồng nhân tạo. Các giống nấm này sẽ được bảo quản và tiếp tục tuyển chọn trong quá trình nuôi trồng để giống nấm ngày một tốt hơn. Phương pháp cải tiến giống này chủ yếu dựa trên các đặc điểm hình thái quả thể hay năng suất nuôi trồng của các giống nấm. Mặc dù, được ứng dụng một thời gian khá dài trước khi có những hiểu biết về di truyền giới tính của các giống nấm nuôi trồng, nhưng những thành công của phương pháp cải tiến này lại rất hạn chế. Nguyên nhân là do khả năng xuất hiện các đột biến mang những ưu điểm vượt trội thường rất thấp. Hơn nữa, các đột
5 biến này hầu hết là kết quả của việc đột biến 1 vài gen đơn lẻ. Các gen này có thể phục hồi hoặc tiếp tục biến đổi khi có những thay đổi nhỏ trong điều kiện nuôi trồng hay khi cấy chuyền liên tục trong sản xuất giống. Kết quả là chất lượng và năng suất nuôi trồng của các giống nấm này thường không ổn định (Chang và Buswell 1993).
1.2.4.2. Phương pháp chuyển gen
Hiện nay, các công trình nghiên cứu chuyển gen vào nấm đã được thực hiện. Tuy nhiên các nghiên cứu này chỉ dừng lại ở mức độ đánh giá khả năng chuyển các vật liệu di truyền ngoại lai (như gen, chromosome hoặc nhân) vào các loài nấm bậc cao, hoặc dùng để nghiên cứu chức năng gen hay đặc điểm di truyền... Cho đến nay, ngoài các giống nấm được chuyển nhân bằng dung hợp tế bào trần chưa có bất kỳ giống nấm chuyển gen nào được thương mại hóa.
Các phương pháp chuyển gen được sử dụng bao gồm chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp. Các DNA trần có khả năng tự nhân lên hay tự chèn vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ được đưa vào sợi nấm bằng các phương pháp chuyển gen trực tiếp như: vi tiêm, bắn gen, dung hợp tế bào trần (Chang và Buswell 1993), (Li và Huaqing 2001), (Sunagawa và Magae 2002). Phương pháp chuyển gen gián tiếp thì sử dụng vi khuẩn gram âm Agrobacterium tumefaciens chứa T-DNA để đưa các gen ngoại lai vào hệ sợi nấm đồng nhân (homokaryon) hoặc sợi nấm dị nhân (heterokaryon) (Mikosch và cộng sự 2001), (Zang và cộng sự 2014).
1.2.4.3. Phương pháp lai
Đây là phương pháp cải tiến giống chủ yếu trong ngành nấm. Hầu hết các giống nấm cải tiến hiện nay đều được tạo ra bằng phương pháp này. Phương pháp lai có thể chia thành 2 nhóm khác nhau, đó là: lai truyền thống và lai bằng dung hợp tế bào trần.
Phương pháp lai truyền thống
Phương pháp lai này ra đời vào những năm 1980, dựa trên đặc tính bắt cặp của hệ sợi nấm và có thể áp dụng cho cả 2 nhóm nấm đồng tản và dị tản. Trong đó, nếu xét về nguồn gốc của các đối tượng lai, phương pháp lai có thể chia làm 2 kiểu, đó là: tự lai (self – mating) và lai chéo (cross – mating). Tự lai là lai giữa 2 dòng của cùng một giống bố mẹ, lai chéo là lai giữa 2 dòng của 2 giống bố mẹ khác nhau (Chang và Buswell 1993).
6 Ngành nuôi trồng nấm hiện nay có khá nhiều giống nấm thương mại hóa thành công có nguồn gốc từ lai tạo bằng phương pháp lai truyền thống. Trong đó, có những giống lai đã góp phần thúc đẩy ngành nuôi trồng nấm phát triển vượt bậc như các chủng nấm mỡ Agaricus bisporus Horst U1, U3 được tạo ra bởi Fritsche tại Hà Lan năm 1978 (Van 1988) hay chủng nấm Flammulina velutipes M-50 được Kitamoto và cộng sự tạo ra tại Nhật Bản năm 1985 (dẫn lại theo Chang và Buswell 1993). Các chủng nấm Horst U1 và U3 đã giúp ngành nuôi trồng nấm mỡ phát triển thành một ngành công nghiệp tại Châu Âu như ngày nay. Trong khi đó, giống nấm F. velutipes M-50 đã đưa loại nấm này từ một loài hoang dại, khó trồng trở thành một trong những loại nấm được trồng với quy mô công nghiệp nhiều nhất ở các nước Đông Á.
Mặc dù, hiện nay có nhiều phương pháp lai tạo mới hiện đại hơn, nhưng phương pháp lai truyền thống với nhiều ưu điểm như quy trình thực hiện đơn giản, ít tốn kém, các giống lai tạo ra ổn định di truyền, vẫn là phương pháp yêu thích của hầu hết các nhà lai tạo nấm.
Phương pháp dung hợp tế bào trần
Quy trình lai tạo giống nấm bằng phương pháp dung hợp tế bào trần gồm các bước như sau: phân lập các tế bào trần đơn nhân, dung hợp các tế bào trần, tái tạo sức sống cho các tổ hợp lai dị nhân, tuyển chọn và đánh giá khả năng hình thành quả thể và các đặc tính mong muốn của các tổ hợp lai thành công. Với phương pháp này, các tế bào có thể tiếp xúc và trao đổi vật chất di truyền với nhau mà hoàn toàn không bị giới hạn bởi hàng rào di truyền tự nhiên, một vấn đề thường hay gặp trong các phương pháp lai truyền thống. Kết quả là tỉ lệ dung hợp thành công luôn rất cao, từ dung hợp giữa các tế bào khác chủng cùng loài, đến các tế bào khác loài cùng chi, thậm chí là giữa cáctế bào khác chi với nhau (Chang và Buswell 1993).
Mặc dù quá trình dung hợp các tế bào trần hoàn toàn không bị chi phối bởi các nhân tố bắt cặp nhưng sự hình thành và phát triển quả thể của tổ hợp lai thì bị chi phối bởi sự tương hợp loài. Ví dụ như các tổ hợp lai được tạo ra bằng phương pháp dung hợp tế bào trần giữa các loài Pleurotus tương hợp nhau (P. ostreatus + P. ostreatus, P.
ostreatus + Pleurotus florida, P. florida + P. sajor-caju, P. ostreatus + P. sajor-caju) mang những đặc tính tương tự như những tổ hợp lai được tạo bằng phương pháp lai chéo: hệ sợi nấm dị nhân tạo mấu nối hoàn chỉnh trên môi trường CM (complete media)
7 bán rắn, hình thành quả thể sớm và cho năng suất cao khi nuôi trồng trên môi trường cơ chất mạt cưa bổ sung cám gạo. Trong khi đó, các tổ hợp lai giữa những loài không tương hợp nhau (P. cornucopiae + P. florida, P. cornucopiae + Pleurotus salmoneostramineus, P. florida + P. sajor-caju, P. florida + P. salmoneostramineus, P. ostreatus + P. sajor-caju, P. salmoneostramineus + P. sajor-caju, P. sajor-caju + P. sapidus) khi nuôi cấy trên môi trường MM (minium media) cho hệ sợi nấm phát triển rất chậm và hình dạng sợi nấm bị méo mó. Khi chuyển sang môi trường CM thì các tổ hợp lai phân chia thành 3 dạng: tổ hợp lưỡng bội, tổ hợp dị nhân ổn định và tổ hợp đồng nhân. Các tổ hợp dị nhân trong trường hợp này tạo hệ sợi phát triển chậm hơn các tổ hợp dị nhân của những loài tương hợp nhau. Ngoại trừ một vài tổ hợp dị nhân, thì tất cả các tổ hợp lai giữa những loài không tương hợp đều hình thành hệ sợi nấm không mấu nối, cũng như không thể tạo quả thể trên môi trường CM dạng bán rắn hay dạng lỏng.
Tuy nhiên, khi nuôi các tổ hợp này trên môi trường mạt cưa bổ sung 20% cám gạo và cảm ứng chu kỳ sáng tối thì chúng đều có thể hình thành nụ nấm. Những nụ nấm này đều được cấu tạo bởi các sợi nấm có mấu nối, ngoại trừ các nụ nấm của tổ hợp P.
cornucopiae + P. florida và P. florida + P. salmoneostramineus không có mấu nối ở hệ sợi. Và tất cả các nụ nấm mà hệ sợi của chúng không có mấu nối đều không thể phát triển thành tai nấm trưởng thành, ngoại trừ các nụ nấm của tổ hợp P. florida + P.
salmoneostramineus. Khi các nụ nấm có mấu nối và các tai nấm trưởng thành của các tổ hợp lai này được phân lập và nuôi cấy cho thấy: sợi nấm mới có sức sống mạnh hơn sợi nấm ban đầu của tổ hợp lai và tất cả chúng đều hình thành mấu nối (Chang và Buswell 1993).
Các nghiên cứu dung hợp tế bào trần cũng cho thấy: mặc dù kỹ thuật này có thể dung hợp thành công các dòng đơn bội của hai giống nấm cùng loài hay khác loài, tương hợp hay không tương hợp, nhưng chỉ những tổ hợp lai của các giống nấm có quan hệ sinh học gần nhau thì mới có khả năng hình thành quả thể. Trong khi đó, việc lai các giống có quan hệ xa nhau thì có ý nghĩa đối với các nghiên cứu di truyền học.
Hiện nay, có khá nhiều giống nấm lai tạo bằng dung hợp tế bào trần đã được thương mại hóa thành công. Ví dụ như giống nấm bào ngư P72 của Hàn Quốc, tên là
“Wonhyeongneutaribeosus”, được phân phối cho nông dân nuôi trồng rất thành công
8 vào năm 1990. So với các giống bố mẹ thì giống này có sự khác biệt trong hình thái như mũ nấm lớn hơn, cuống nấm to và dài hơn (Chang và Buswell 1993).
Với khả năng dung hợp tế bào hết sức hiệu quả, phương pháp dung hợp tế bào trần được đánh giá sẽ trở thành phương pháp cải tiến giống nấm quan trọng nhất trong tương lai, cũng như là một công cụ đắc lực trong các nghiên cứu về di truyền nấm bậc cao. Như vậy, có thể thấy rằng, dù là lai truyền thống hay lai bằng dung hợp tế bào trần thì ít nhất 1 trong 2 giống nấm bố mẹ sử dụng cho lai tạo phải ở dạng đơn bội và sự tương hợp loài có vai trò quan trọng đối với sự hình thành và phát triển quả thể của tổ hợp lai tạo ra.
Nghiên cứu về kiểu bắt cặp của hệ sợi đơn bội của P. corticatus được thực hiện bởi Kaufert (1935) (dẫn lại theo Raper 1966). Các yếu tố tương hợp về di truyền của P.
ostreatus đã được Terakawa (1957, 1960) chứng minh (dẫn lại theo Raper 1966). Hiện nay, phương pháp cải tiến giống bằng tuyển chọn hoặc phương pháp lai vẫn được ưu tiên áp dụng. Nguồn nguyên liệu cần cho các phương pháp này chính là các chủng nấm có đặc điểm nuôi trồng mong muốn và các dòng đơn bội phân lập từ các chủng này.